JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:27 min. • July 8th, 2025
Prendi colture aderenti di cellule precursori primarie di oligodendrociti, o OPC, in un mezzo di crescita.
Aggiungere i vettori lentivirali di controllo al pozzetto di controllo e testare i vettori, codificanti le proteine di segnalazione che regolano la mielinizzazione, al pozzetto del test, quindi incubare.
Le cellule internalizzano i vettori e l'RNA virale viene trascritto inversamente in DNA e incorporato nel genoma ospite, esprimendo le proteine di segnalazione nelle cellule di prova.
Introdurre enzimi per staccare gli OPC dal substrato.
Neutralizzare gli enzimi e centrifugare per rimuovere gli enzimi.
Aggiungere il terreno di coltura e trasferire gli OPC su vetrini coprioggetti all'interno di una micropiastra con ganglio radicolare dorsale aderente o neuroni DRG. Lasciate che gli OPC si stabiliscano.
Riempire i pozzetti con il terreno di coltura e incubare. L'interazione con i neuroni DRG innesca la maturazione di OPC in oligodendrociti.
Le proteine di segnalazione espresse inducono gli oligodendrociti a formare guaine mieliniche attorno ai neuroni DRG.
Valutare la formazione di guaina mielinica indotta dalla proteina di segnalazione nelle cellule di prova rispetto alle cellule trasdotte dal vettore di controllo.
Per questo protocollo, avere cellule precursori di oligodendrociti primari, OPC, coltivate in piastre di 10 centimetri con 10 millilitri di terreno SATO contenenti i seguenti fattori di crescita: CNTF, PDGF, NT3 e Forskolina. Le cellule devono essere state coltivate per 24 ore con una temperatura inferiore all'8% di anidride carbonica.
Iniziare con l'aspirazione del supporto e rimuoverlo completamente. Quindi, sostituirlo con 10 millilitri dello stesso terreno con i fattori di crescita. Infetta i tuoi OPC con lentivirus, esprimendo la proteina di interesse aggiungendo il volume richiesto di virus per goccia nel terreno.
Inoltre, in una piastra OPC separata, miscelare il lentivirus di controllo che esprime solo GFP nel terreno. Coltiva le cellule per altre 48 ore, quindi raccogli gli OPC dalle piastre per la semina sui neuroni DRG in coltura.
Per prima cosa, sciacquare due volte ogni piastra con 8 millilitri di EBSS. Preparare 1 millilitro di tripsina-EDTA 0,05% con 9 millilitri di EBSS caldo. Aggiungere 5 millilitri di tripsina diluita a ciascuna piastra. Incubare a 37 gradi Celsius per un massimo di due minuti. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 5 millilitri di FBS al 30% in EBSS.
Quindi, utilizzando una pipetta da 10 millilitri, lavare gli OPC dalla superficie della piastra. Gira la piastra di un quarto di giro ogni volta per raccogliere tutte le celle. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare le celle a temperatura ambiente per 15 minuti a 180 g.
Ora, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno SATO caldo senza fattori di crescita e contare le cellule. Successivamente, preparare i neuroni DRG che vengono coltivati sui vetrini coprioggetti da 22 millimetri aspirando completamente il terreno dalla loro piastra.
Quindi, semina delicatamente 200.000 OPC, goccia a goccia, su ciascun vetrino coprioggetti. Il volume di semina deve essere inferiore a 200 microlitri per vetrino coprioggetti. Lascia che le cellule si depositino senza muovere la piastra. Dopo 10 minuti, riempire ogni pozzetto con un millilitro di terreno SATO caldo. Ora riplaccare le OPC sorelle rimanenti con terreni SATO contenenti fattori di crescita. Possono essere utilizzati in seguito per verificare l'espressione della proteina di interesse.