Isolamento delle pieghe neurali craniche da un embrione di pollo per una coltura di cellule neurali in cresta

Prendi un embrione di pollo supportato da una cornice di carta da filtro e posizionalo sotto un microscopio da dissezione.

Rimuovere la membrana vitellina, un rivestimento protettivo che circonda l'embrione.

Identificare le pieghe neurali del mesencefalo situate posteriormente ai lobi ottici e anteriormente alla mezzaluna cardiaca, il precursore embrionale del cuore maturo.

Le pieghe neurali contengono cellule della cresta neurale premierarie, che sono cellule staminali multipotenti che si trasformano in cellule migratorie durante lo sviluppo.

Queste cellule migratorie si differenziano in cellule neuronali e non neuronali.

Asportare l'aspetto più dorsale delle pieghe neurali e trasferire il tessuto in una piastra di coltura contenente tampone.

Quindi, posizionare i vetrini coprioggetti rivestiti con una proteina di adesione nei pozzetti della piastra di coltura contenenti terreni.

Trasferisci le pieghe neurali sui vetrini coprioggetti rivestiti. Incubare per facilitare l'adesione dei tessuti.

Durante la coltivazione, le cellule della cresta neurale migratoria emergono dalle pieghe neurali sulla superficie rivestita, stabilendo una coltura cellulare della cresta neurale.

Trasferisci un embrione in un piatto pulito contenente la soluzione Ringer's Pen-Strep. Agita delicatamente l'embrione avanti e indietro per eliminare il tuorlo che oscura la vista e scambia la soluzione di Ringer's Pen-Strep o trasferiscila in un piatto fresco se diventa torbido. Posizionare l'embrione dorsalmente e con il montatura rivolto verso l'alto sotto un microscopio da dissezione. Lascia l'embrione sul telaio di carta per tenerlo allungato e tenuto in posizione.

Quindi, rimuovere la membrana vitellina usando una pinza per esporre le pieghe neurali. Includere il tessuto caudale alle vescicole ottiche in espansione e rostrale al romboencefalo, dove le costrizioni dei rombomeri stanno appena iniziando a comparire. Usando le forbici a molla, asportare con cura le pieghe neurali del mesencefalo. Fare attenzione a asportare l'aspetto più dorsale della piega neurale con una contaminazione minima del tubo neurale e dell'ectoderma non neurale e trasferire le pieghe neurali in un piatto pulito contenente la soluzione Ringer's Pen-Strep utilizzando un pipettatore P20 o una pipetta sterile in vetro Pasteur risciacquata con la soluzione Yolky Ringer's Pen-Strep.

Conservare le pieghe raccolte sul ghiaccio mentre si sezionano le pieghe aggiuntive. Dopo aver rimosso il piatto di coltura dall'incubatrice, utilizzare un pipettatore o una pipetta Pasteur per rimuovere la soluzione di fibronectina dal piatto o dal pozzetto dei vetrini. Dopo aver risciacquato il substrato rivestito di fibronectina con la soluzione Ringer's Pen-Strep, aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura completo alla piastra o al pozzetto.

Per bloccare la plastica ed evitare che il fazzoletto si attacchi, utilizzare un pipettatore P20 o P200 e sciacquare la punta della pipetta con la soluzione Yolky Ringer's Pen-Strep. Quindi, trasferire le pieghe neurali isolate verso il centro del vetrino coprioggetti rivestito di fibronectina, avendo cura di trasferire la minor quantità possibile di soluzione di Ringer's Pen-Strep. Dopo aver lasciato riposare gli espianti per 10-15 minuti, posizionarli in una camera umidificata a 38 gradi Celsius trasportando lentamente e con attenzione la piastra di coltura con le pieghe neurali placcate.