Isolamento dei neuroni gangliari vestibolari da un orecchio interno di topo

Prendi metà della testa di un cucciolo di topo e rimuovi il cervello.

Taglia la parte superiore del cranio e asporta il tessuto circostante per visualizzare la capsula otica, uno strato esterno osseo che protegge le strutture dell'orecchio interno.

Trasferire il tessuto in una piastra di coltura contenente un terreno tamponato.

Separare i gangli vestibolari superiori e inferiori, che contengono i corpi cellulari nervosi vestibolari.

Radere la cresta ossea e raccogliere il ganglio superiore sottostante.

Trasferire il ganglio superiore in una piastra fresca contenente il mezzo tamponato.

Rimuovere i tessuti aderenti dalla superficie per pulire il ganglio isolato.

Porre il ganglio in una soluzione contenente enzimi proteolitici.

Gli enzimi degradano la matrice extracellulare del tessuto, allentando le cellule.

Trasferire il ganglio in una capsula con fondo di vetro rivestita di polimero contenente terreno di coltura e dissociare meccanicamente il tessuto per rilasciare le cellule.

Incubare, permettendo alle cellule di aderire e stabilire una coltura di neuroni gangliari vestibolari.

Estrarre il cervello del topo soppresso usando le forbici chirurgiche chiuse. Recidere e rimuovere il nervo cranico per staccare completamente il cervello dal cranio. Partendo dalla parte posteriore della testa, estrarre il materiale membranoso trasparente con una pinza, quindi tagliare la parte superiore del cranio usando le forbici chirurgiche.

Rimuovere il tessuto in eccesso dalla parte posteriore della testa e del collo, per rendere l'area di dissezione e la capsula otica, più pulite e di più facile accesso. Trasferire il fazzoletto in una seconda piastra di Petri con una soluzione fresca di L-15. Quindi, localizzare la capsula otica e i nervi uditivi, vestibolari superiori e vestibolari inferiori. Separare i gangli superiori e inferiori usando piccole forbici a molla e tagliare via il nervo uditivo.

Usando un bisturi, radere delicatamente la cresta ossea per indebolire l'area ossea sotto la quale il nervo si tuffa nella capsula ossea. Rimuovere con cura i detriti con un bisturi, esponendo l'intera parte gonfia del ganglio.

Usa le forbici a molla fine per tagliare e separare il ganglio dal ramo nervoso periferico che si sta tuffando verso l'utricolo. Rimuovere il ganglio superiore utilizzando una pinza fine e trasferirlo in una capsula di Petri da 35 millimetri con una soluzione fresca di L-15.

Dopo aver preriscaldato la soluzione enzimatica, versare la miscela enzimatica in una capsula di Petri da 35 millimetri e metterla in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Pulisci il ganglio usando una pinza fine e piccole forbici a molla rimuovendo l'osso, il tessuto in eccesso, le fibre nervose e qualsiasi altra struttura superflua. Fare attenzione a ridurre al minimo la rimozione di qualsiasi tessuto gangliare.

Trasferire i gangli puliti nella soluzione enzimatica preriscaldata e rimetterli nell'incubatore per 10-40 minuti. Quindi, trasferire i gangli nella piastra di Petri da 35 millimetri con una soluzione fresca di L-15.

Dopo due o tre minuti, trasferire i gangli in un'altra piastra di Petri da 35 millimetri riempita con terreni di coltura filtrati. Trasferire circa 150 microlitri di terreno di coltura filtrato su un piatto di vetro rivestito. Quindi, trasferire il numero desiderato di gangli sul vetrino coprioggetti.

Prelevare una piccola quantità di terreno di coltura dalla piastra di coltura e sciacquare la pipetta di triturazione con il terreno per evitare che il tessuto si attacchi ai lati della pipetta di vetro. Triturare facendo passare delicatamente e ripetutamente il tessuto attraverso la pipetta fino a quando i gangli non sono sufficientemente dissociati.

Dopo cinque minuti, controllare al microscopio ottico se le cellule si sono depositate sul vetrino. Posizionare con cura un piatto di coltura in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 12-24 ore.