Isolamento e coltura di motoneuroni oculomotori, trocleari e spinali da un embrione di topo

Prendi una topolina gravida transgenica e rimuovi chirurgicamente l'utero con embrioni contenenti motoneuroni marcati in fluorescenza.

Trasferisci l'utero in una piastra con un tampone ghiacciato al microscopio a fluorescenza.

Usa la luce visibile per isolare gli embrioni.

Rimuovere il viso e la coda degli embrioni e orientarli in posizione prona.

Utilizzando il segnale di fluorescenza, praticare un'incisione nel mesencefalo per esporre i nuclei oculomotorio e trocleare, che contengono motoneuroni.

Isolare il mesencefalo contenente i nuclei.

Aprire il lato dorsale del rombencefalo e del midollo spinale. Isolare il midollo spinale, asportare entrambe le estremità e raccogliere le colonne contenenti i motoneuroni spinali.

Trattare i tessuti raccolti con enzimi per dissociare la matrice tissutale. Raccogli le singole cellule e isola i neuroni marcati in fluorescenza utilizzando FACS.

Aggiungere un terreno di coltura ai neuroni isolati, trasferire le cellule su una micropiastra rivestita di substrato di coltura e incubare, consentendo alle cellule di aderire e crescere.

Mantenere i motoneuroni in coltura.

Inizia raccogliendo gli embrioni EGF-positivi dell'Islet-1 da un topo gravido circa 11,5 giorni dopo la fecondazione. Spruzzare accuratamente l'addome con etanolo e rimuovere l'utero con forbici sterili per microdissezione e una pinza per medicare il pollice. Lavare brevemente l'utero con PBS sterile. Quindi, trasferirlo nella piastra di dissezione riempita con PBS sterile pre-raffreddato.

Sotto la luce intensa del microscopio, rimuovere con cura gli embrioni dall'utero utilizzando le forbici da microdissezione, le pinze per la medicazione del pollice e le pinzette Dumont numero 5. Quindi, utilizzare un cucchiaio miniforato Moria sterile per trasferire ogni embrione in un pozzetto separato di una piastra a 24 pozzetti riempita con terreno a bassa fluorescenza Hibernate E pre-raffreddato integrato con 1X V27.

Mantenendo la piastra sul ghiaccio, trasferire un embrione in una piastra di dissezione sterile e coprirla completamente con la soluzione salina bilanciata di Hank sterile ghiacciata o HBSS. Usa una pinzetta per rimuovere la faccia dell'embrione e la coda senza danneggiare il mesencefalo. Quindi, posizionare l'embrione prono con gli arti a cavalcioni e la coda rivolta verso la parte anteriore del microscopio.

Usa una pinzetta per aprire il tetto del quarto ventricolo in modo da generare una piccola apertura. Usa questa apertura per agganciare le pinzette nello spazio creato tra il quarto ventricolo e il suo tetto. Sezionare lungo la superficie dorsale dell'embrione rostrale alla corteccia e lateralmente alla piastra del pavimento e alla colonna motoria.

Quindi, aprire il tessuto sezionato a libro aperto per rivelare i nuclei CN3 e CN4 GFP-positivi. Separare con cura il mesencefalo ventrale dall'embrione e rimuovere il tessuto meningeo con una pinzetta e un coltello da microdissezione.

Sezionare i nuclei bilaterali CN3 e CN4 GFP-positivi lontano dalla piastra del pavimento e da altri tessuti circostanti GFP-positivi, facendo attenzione a non toccare o danneggiare i neuroni. Se si raccolgono nuclei CN3 e CN4 separati, tagliare lungo il mesencefalo di questi due nuclei e utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere il tessuto mesencefalico ventrale sezionato con HBSS minimo.

Metterlo in una provetta per microcentrifuga da 1,7 millilitri etichettata riempita con mezzo di dissezione. Conservare il tubo in ghiaccio fino alla dissociazione. Continuare a raggruppare i mesencefali ventrali da ulteriori embrioni nella stessa provetta fino a quando il numero totale soddisfa i requisiti sperimentali.

Per sezionare il midollo spinale ventrale, mantenere l'embrione prono con la testa rivolta verso la parte anteriore del microscopio. Tienilo con un paio di pinzette e inserisci la punta dell'altro paio nella parte caudale non aperta del quarto ventricolo. Aprire il resto del rombencefalo e del midollo spinale dorsalmente su tutta l'estensione rostrocaudale dell'embrione. Tagliare il tessuto dorsale partendo dal quarto ventricolo e procedendo verso il canale centrale del midollo spinale caudale, utilizzando la pinza come forbici.

Quindi, tieni l'embrione con una serie di pinzette e pizzica il lembo del tessuto dorsale su ciascun lato con l'altro paio. Rimuovere il midollo spinale ventrale utilizzando il coltello da microdissezione per perforare direttamente sotto l'SMN positivo alla GFP, sollevando il midollo spinale ventrale con movimenti simili a seghe su entrambi i lati.

Tagliare il midollo spinale trasversalmente al limite superiore dell'arto inferiore e rimuovere la parte lombare cervicale. Tagliare trasversalmente direttamente sopra C1 dove sporge il primo corno anteriore positivo alla GFP. Posizionare il midollo spinale ventrale con il lato dorsale rivolto verso l'alto e tenerlo premuto premendo il tessuto GFP-negativo tra le colonne SMN GFP-positive con un paio di pinzette.

Rimuovere il mesenchima attaccato rimanente, i DRG e il midollo spinale dorsale tagliando entrambi i lati della colonna SMN GFP-positiva con il coltello per microdissezione. Utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere il tessuto del midollo spinale ventrale sezionato con HBSS minima e posizionarlo in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri etichettata riempita con terreno di dissezione. Conservalo in ghiaccio fino alla dissociazione e continua a raggruppare il midollo spinale ventrale da altri embrioni nella stessa provetta.

Aggiungere il volume appropriato di soluzione di papaina a ciascuna delle provette da microcentrifuga con i campioni di tessuto sezionati. Incubare le provette a 37 gradi Celsius per 30 minuti, agitando le provette ogni 10 minuti con un gesto delle dita.

Dopo l'incubazione, triturare delicatamente ogni sospensione otto volte con una pipetta P200. Centrifugare a 300 volte g per cinque minuti. Risospendere i pellet cellulari con il volume appropriato di soluzione di inibitore dell'albumina ovomucoide pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso. Ripetere la centrifugazione. Quindi, rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta P1000. Risospendere le cellule nel volume appropriato del mezzo di dissezione. Filtrare le sospensioni attraverso filtri cellulari da 70 micrometri.

Successivamente, utilizzare lo smistamento FACS per isolare le cellule GFP-positive sezionate da CN3, CN4 e SMN. Diluire le sospensioni cellulari isolate con terreno di coltura di motoneuroni preriscaldato a 37 gradi Celsius alle densità appropriate e aggiungere 200 microlitri di sospensione a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rivestita di lamina PDL. Coltiva i neuroni in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, assicurandoti di rinfrescare il terreno di coltura dei motoneuroni ogni cinque giorni.