Purificazione di cellule precursori endoteliali CD31⁺ mediante smistamento cellulare attivato da magneti

Prelevare una coltura aderente di cellule progenitrici endoteliali o EPC, precursori delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali.

La coltura, ottenuta differenziando cellule staminali pluripotenti, comprende EPC positive per il marcatore di superficie CD31 e cellule CD31-negative contaminanti.

Incubare con un reagente di dissociazione per staccare le cellule e filtrare per ottenere una sospensione a cellula singola.

Aggiungere un terreno per neutralizzare gli enzimi, centrifugare per scartare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone.

Incubare con un reagente bloccante per inibire i recettori Fc cellulari, impedendo la marcatura non specifica.

Aggiungere un anticorpo coniugato con fluorofori specifico per CD31 e incubare per marcare le EPC.

Centrifugare e scartare gli anticorpi non legati. Incubare con complessi anticorpali contenenti un anticorpo che si lega ai fluorofori.

Introdurre nanoparticelle magnetiche rivestite di polimero e incubare, consentendo alle nanoparticelle di legarsi al secondo anticorpo dei complessi.

Utilizzando un campo magnetico, isolare le cellule legate alle nanoparticelle.

Eliminare la sospensione con cellule CD31-negative non marcate e risospendere le cellule purificate in un terreno. Le EPC CD31-positive sono pronte per i saggi a valle.

Il 5° giorno di coltura delle cellule progenitrici endoteliali, aspirare il terreno dai pozzetti e aggiungere 1 millilitro di reagente di dissociazione a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 6-8 minuti a 37 gradi Celsius. Utilizzando una micropipetta, dissociare e singolarizzare le cellule, quindi far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per filtrare in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di terreno DMEM/F-12.

Per fermare la reazione di digestione, aggiungere DMEM/F-12/10 10 medium fino a 50 millilitri. Pipettare accuratamente e riservare 10 microlitri per il conteggio delle cellule. Centrifugare la provetta da 50 millilitri a 200 g per 5 minuti a 20-25 gradi Celsius per pellettare le cellule. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 millilitri di terreno DMEM/F-12/10.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta fresca da 15 millilitri. Centrifugare a 200 g per cinque minuti a 20-25 gradi Celsius per pellettare nuovamente le cellule. Quindi, risospendere il pellet della cella nel buffer di flusso 1. Quindi, aggiungere il reagente bloccante FcR in un rapporto da 1 a 100 e incubare per 5 minuti. Quindi, aggiungere l'isotiocianato di fluoresceina diluito con rapporto 1-200 o l'anticorpo CD31 marcato con FITC.

Incubare la sospensione per 30 minuti al buio a una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 10 millilitri di tampone di flusso 1 al campione e riservare 10 microlitri della sospensione per l'analisi di citometria a flusso per determinare la frazione di cellule CD31-positive. Centrifugare le celle a 200 g per 5 minuti a 20-25 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule con la soluzione del tampone di flusso 1.

Successivamente, aggiungere 5 microlitri del cocktail di selezione FITC per 100 microlitri di sospensione cellulare. Mescolare accuratamente la soluzione pipettandola e incubare al buio per 15 minuti a una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 5 microlitri di nanoparticelle magnetiche per 100 microlitri di sospensione cellulare. Pipettare bene la miscela e incubare al buio per 10 minuti a 20-25 gradi Celsius.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per citometria a flusso da 5 millilitri e aggiungere il tampone di flusso 1 per ottenere un volume totale di 2,5 millilitri. Quindi, posizionare la provetta per citometria a flusso nel magnete per cinque minuti. Con un movimento continuo, capovolgere il magnete e decantare la sospensione cellulare contenente cellule non marcate con anticorpi FITC-CD31. Mantenere il magnete e il tubo in posizione capovolta per 2 o 3 secondi, quindi rimuovere il liquido rimanente.

Aspirare eventuali goccioline sul bordo del tubo prima di riportare il tubo in posizione verticale. Recuperare la provetta per citometria a flusso dal magnete e aggiungere 2,5 millilitri di tampone di flusso 1 per lavare le restanti cellule CD31-positive. Pipettare delicatamente le cellule su e giù, due o tre volte per risospenderle. Quindi, posizionare il tubo di flusso nel magnete per cinque minuti.

Ripetere il lavaggio almeno quattro volte per rimuovere le cellule non etichettate FITC-CD31 dal tubo. Rimuovere il tubo di flusso dal magnete e risospendere le cellule CD31-positive purificate con la quantità desiderata di un mezzo adatto. Riservare due aliquote da 1 microlitro della sospensione, una per il conteggio delle cellule e la seconda per eseguire l'analisi di citometria a flusso per valutare la purezza delle cellule CD31-positive nei campioni di selezione delle cellule attivate post-magnetiche.