Differenziazione delle cellule staminali neurali umane in progenitori neurali e astrocitari

Iniziamo con le neurosfere non aderenti, un aggregato tridimensionale di cellule staminali neurali umane in un mezzo condizionato derivato da colture cellulari.

Questo terreno contiene sostanze nutritive, fattori di crescita e componenti della matrice extracellulare che mantengono la vitalità cellulare.

Centrifuga per raccogliere le neurosfere.

Trattali con tripsina ed enzimi DNasi, mescola il contenuto e poi incubali.

La tripsina interrompe l'adesione cellula-cellula e facilita il distacco cellulare, mentre la DNasi degrada il DNA libero per prevenire l'aggregazione cellulare.

Pipettare ripetutamente il contenuto per formare una sospensione unicellulare. Quindi, aggiungi un inibitore della tripsina per neutralizzare l'attività enzimatica.

Centrifugare e rimuovere il surnatante, quindi risospendere le cellule in un mezzo di proliferazione contenente fattori di crescita neurali.

Seminare la sospensione cellulare su un vetrino coprioggetti rivestito di polimero posto in una piastra a più pozzetti. Incubare per consentire l'adesione delle cellule staminali al polimero.

Inoltre, in base all'assorbimento di specifici fattori di crescita, le cellule staminali si differenziano in progenitori neurali e astrociti, che sono pronti per un'ulteriore maturazione in tipi di cellule specializzate.

Dopo aver preparato il terreno di coltura e aver piastrato le cellule staminali neurali umane secondo il protocollo di testo, prelevare dall'incubatore il pallone di cellule da far passare e portarlo nella cabina di biosicurezza o BSC. Inclinare delicatamente il pallone, lasciando che le cellule affondino sul fondo del terreno accumulato.

Trasferire 10 millilitri di terreno in due porzioni da 5 millilitri in un tubo pulito da 15 millilitri etichettato "CM" per un mezzo condizionato. Fare attenzione a non aspirare nessuna delle cellule depositate nel pallone. Trasferire 3 millilitri di terreno dalla provetta CM a una provetta da 15 millilitri etichettata come "soluzione inibitrice della tripsina". Quindi, metti da parte il tubo CM.

Quindi, rimuovere i 5 millilitri di terreno e le cellule rimanenti nel pallone T75 e metterlo in una provetta pulita da 15 millilitri etichettata come "cellule". Quindi, utilizzando una pipetta sierologica e volumi di 3,5 millilitri di CM, sciacquare due volte il pallone T75, trasferendo il risciacquo CM nel tubo "cellule". Questo rimuoverà tutte le neurosfere dal pallone T75.

Centrifugare la provetta "cellule" a 100 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Mentre le cellule girano, ottenere la soluzione di glucosio DPBS precedentemente preparata dal bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e aggiungere la quantità appropriata di tripsina e DNasi.

Dopo che la provetta "cellule" ha smesso di girare, rimuovere tutto il surnatante del mezzo condizionato e trasferirlo nella provetta CM. Aggiungere la soluzione di tripsina al pellet cellulare nella provetta da 15 millilitri e utilizzare una pipetta da 5 millilitri per pipettare su e giù circa 5-10 volte. Chiudere il tappo della provetta e incubarla a bagnomaria a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Alla provetta inibitrice della tripsina, aggiungere il volume appropriato di inibitore della tripsina, aggiungendo lo stesso volume di soluzione utilizzato per la soluzione di tripsina. Quindi, mettere la soluzione di inibitore della tripsina nel bagnomaria a 37 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Dopo l'incubazione, pipettare le cellule su e giù da 5 a 10 volte. Quindi, incubare il campione nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per altri 10-15 minuti. Dopo l'incubazione delle cellule, pipettare le cellule su e giù fino a quando le sfere non sono completamente dissociate. Quindi, aggiungere immediatamente la soluzione inibitrice della tripsina e pipettare la sospensione cellulare su e giù per 10 volte.

Per contare il numero di cellule nella sospensione, pipettare 15 microlitri di premiscela di blu di tripano su una piccola navicella di pesa e aggiungere 5 microlitri di sospensione cellulare. Pipettare su e giù da 3 a 5 volte per mescolare. Quindi, trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare di tripano blu su entrambi i lati di un emocitometro, coperto con un vetrino coprioggetti.

Osserva le cellule al microscopio ottico e conta il numero totale di cellule in ciascuna delle quattro griglie angolari. Quindi, somma questi numeri. Dopo aver calcolato il numero di celle secondo il protocollo di testo, aggiungere un volume di sospensione cellulare a ciascun pallone T75 per ottenere 5 x 10⁶ celle per pallone.

Se il volume è inferiore a 5 millilitri, aggiungere ulteriore terreno condizionato fino a 5 millilitri. Quindi, aggiungere al pallone 10 millilitri di nuovo terreno DFHGFPS contenente fattori di crescita. Assicurarsi che il pallone sia etichettato con il tipo di celle, le date, il numero di celle nel pallone e il numero di passaggio. Se lo si desidera, incubare le cellule a questo punto.

Per preparare le HNSC aderenti, il giorno prima del passaggio, pulire la BSC come spiegato nel protocollo di testo e utilizzare una pinza per posizionare singoli vetrini di vetro sterili da 12 millimetri nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Rivestire i pozzetti con vetrini coprioggetti con 250 microlitri per pozzetto di poli-D-lisina allo 0,01% o PDL in acqua sterile e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora. Rimuovere il PDL dai pozzetti, quindi ricoprirli con 1 microgrammo per centimetro quadrato di laminina DPBS.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte. Se non è necessario il giorno successivo, avvolgere il parafilm attorno ai bordi del piatto per sigillarlo e conservarlo a 4 gradi Celsius. Rimuovere la soluzione di laminina in eccesso dai pozzetti attraverso l'aspirazione e utilizzare 0,5 millilitri di DPBS per sciacquare i pozzetti una volta. Quindi, semina le cellule in ciascun pozzetto a una densità compresa tra 0,6 e 1 x 10⁵ cellule per centimetro quadrato.