Generazione di organoidi cerebrali di tipo proencefalico da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Iniziare con una piastra a pozzetti a basso attaccamento contenente cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo o iPSC in un mezzo di cellule staminali integrato con un inibitore della Rho-chinasi.

Gli inibitori entrano nelle cellule, bloccano gli enzimi Rho-chinasi e mantengono la vitalità cellulare. Questo favorisce la formazione di aggregati iPSC.

Sostituire il terreno con un terreno di coltura a base di cellule staminali per consentire la crescita degli aggregati. Trasferiscili in un piatto di coltura a basso attaccamento con un terreno di induzione corticale.

I componenti di questo mezzo fanno sì che le iPSC si differenzino in cellule neuroectodermiche, un precursore neurale.

Trasferire ogni aggregato neuroectodermico su una pellicola con pozzetti poco profondi.

Sostituire il terreno con una matrice a membrana basale e incubare per consentire la solidificazione della matrice e l'intrappolamento degli aggregati.

Trasferire questi aggregati incorporati nella matrice in una piastra contenente un mezzo di induzione corticale e incubare con agitazione.

Nel tempo, le cellule neuroectodermiche utilizzano i fattori di differenziazione e si sviluppano in cellule neuroepiteliali.

Cambia il terreno in un mezzo di differenziazione degli organoidi, che consente alle cellule di maturare in tipi cellulari più specializzati, formando un organoide cerebrale che assomiglia alla corteccia del proencefalo.

Per generare aggregati di cellule staminali pluripotenti, quando le colture di cellule staminali raggiungono una confluenza compresa tra il 70% e il 90%, aggiungere 500 microlitri di reagente di dissociazione cellulare a un pozzetto della piastra di coltura a sei pozzetti per staccare le cellule.

Le cellule staminali pluripotenti indotte, che sono adattate alle condizioni di coltura monostrato, sono un buon tipo di cellula per generare aggregati in quanto sono meno inclini alla morte cellulare indotta dallo stress durante la procedura di dissociazione e aggregazione.

Dopo 5-10 minuti a 37 gradi Celsius, picchiettare delicatamente la piastra e utilizzare 2 millilitri di DMEM/F-12 per lavare le cellule dal fondo del pozzetto. Trasferire la sospensione cellulare risultante in un tubo conico da 15 millilitri e portare il volume della soluzione cellulare fino a 10 millilitri con più terreno DMEM/F-12.

Dopo il conteggio, trasferire 4,5 volte 10 alle terze cellule per aggregato di cellule staminali pluripotenti in una nuova provetta da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet nel volume appropriato di terreno di cellule staminali pluripotenti, integrato con 50 inibitori micromolari di ROCK per ottenere una concentrazione di 4,5 x 10³ cellule per 150 microlitri.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri di cellule ai singoli pozzetti di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti a basso attacco e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per monitorare l'induzione del neuroectoderma anteriore, utilizzare un microscopio per colture tissutali per osservare da vicino i cambiamenti morfologici degli aggregati di cellule staminali pluripotenti ogni giorno a basso ingrandimento.

Il giorno 1 si devono osservare gli aggregati cellulari con bordi chiari. Il giorno 2, aspirare con cura circa 2/3 del terreno senza disturbare gli aggregati cellulari sul fondo di ciascun pozzetto e sostituire il terreno scartato con 100 microlitri di terreno di cellule staminali pluripotenti fresche.

Tra i quattro e i sei giorni dopo, quando gli aggregati cellulari raggiungono i 350-450 micrometri di diametro e mostrano bordi lisci, utilizzare un puntale per pipetta modificato da 100 microlitri per trasferire fino a 20 aggregati in una singola piastra di coltura a basso attacco da 6 centimetri contenente 5 millilitri di terreno di induzione corticale.

Sostituire il terreno di induzione corticale con terreno fresco una volta ogni tre giorni, monitorando quotidianamente la morfologia degli aggregati con l'obiettivo 4x. Dopo quattro o cinque giorni nel mezzo di induzione corticale, i bordi degli aggregati cellulari dovrebbero iniziare a schiarirsi in superficie, indicando la differenziazione neuroectodermica, e dovrebbe emergere l'organizzazione radiale di un epitelio pseudostratificato.

Per incorporare gli aggregati neuroectodermici in un'impalcatura di matrice, riempire un estratto della membrana basale su ghiaccio per due o tre ore. Mentre l'estratto si sta scongelando, usa delle forbici sterili per tagliare la pellicola di paraffina di plastica in un quadrato di 4 x 4 centimetri per 16 organoidi e posiziona ogni pezzo di pellicola su un vassoio vuoto per micropipette da 100 microlitri.

Premere la pellicola di paraffina con la punta del dito guantata in modo che appaiano piccole fossette e pulire la pellicola con etanolo al 70%. Dopo l'irradiazione UV in una cappa di biosicurezza chiusa e sterile per 30 minuti, utilizzare un puntale per pipetta modificato da 100 microlitri con un'apertura da 1 e 1/2 a 2 millimetri per trasferire ciascun aggregato cellulare in una fossetta nel film.

Quando tutti gli aggregati sono stati trasferiti, utilizzare un puntale per pipetta da 100 microlitri non tagliato per aspirare accuratamente il terreno da ciascuna fossetta e aggiungere 40 microlitri di estratto di membrana basale non diluito a ciascun aggregato cellulare.

Fare attenzione a non danneggiare gli organoidi mediante manipolazione brusca o aspirazione nel puntale della pipetta, poiché ciò danneggerebbe il neuroepitelio in via di sviluppo.

Utilizzare la punta della pipetta per posizionare gli aggregati al centro di ogni goccia e utilizzare una pinza sterile per trasferire con cura il foglio di pellicola di paraffina di plastica in una capsula di Petri da 10 centimetri. Mettere il piatto nell'incubatrice per 15-20 minuti.

Mentre l'estratto si sta solidificando, aggiungere 5 millilitri di terreno di induzione corticale fresco a un piatto di coltura a basso attacco di sei centimetri. Al termine dell'incubazione, capovolgere il foglio di pellicola di paraffina e utilizzare una pinza sterile per spremere delicatamente fino a 16 goccioline polimerizzate in ciascun piatto di 6 centimetri. Quindi, rimettere gli aggregati nell'incubatore per colture cellulari.

Il giorno successivo, trasferire i piatti di coltura degli organoidi su un agitatore per colture cellulari oscillante inclinato di un angolo di 5 gradi a 14 giri/min all'interno di un incubatore per colture cellulari con monitoraggio giornaliero al microscopio ottico fino a quando gli aggregati non raggiungono la fase di differenziazione di interesse.