Isolamento delle cellule gliali enteriche dalla sottomucosa e dalla lamina propria di un topo

Prendiamo un segmento di intestino tenue di topo precedentemente spogliato del muscolo longitudinale e del plesso mioenterico, degli strati contenenti neuroni enterici e delle cellule gliali.

Tagliare il fazzoletto e metterlo in un tampone contenente EDTA. Incubare con dondolo.

L'EDTA interrompe le giunzioni cellula-cellula, staccando la mucosa epiteliale dalla sottostante lamina propria e dalla sottomucosa, gli strati di tessuto connettivo contenenti cellule gliali enteriche.

Pipettare ripetutamente per rimuovere le cellule epiteliali.

Filtrare attraverso un filtro a celle ed eliminare il flusso.

Trasferire il tessuto in un tampone di dissociazione non enzimatico e incubarlo con l'oscillazione. Il tampone di dissociazione allenta la lamina propria e la matrice extracellulare sottomucosa, staccando le cellule.

Pipettare ripetutamente per dissociare ulteriormente le cellule.

Filtrare attraverso un colino cellulare per raccogliere le cellule.

Centrifugare e risospendere le cellule in un tampone.

Prelevare pozzetti rivestiti di proteine di adesione contenenti un terreno di crescita gliale e placcare le cellule.

Il rivestimento facilita l'adesione cellulare, mentre i fattori di crescita promuovono selettivamente la proliferazione delle cellule gliali, stabilendo una coltura cellulare gliale della lamina propria e della sottomucosa.

Per rimuovere la mucosa epiteliale, per prima cosa, usa le forbici sottili per tagliare l'intestino in pezzi di circa 0,5 centimetri e raccogli i pezzi in 30 millilitri di soluzione EDTA/HEPES/DPBS ghiacciata. Agitare la soluzione contenente tessuto a 4 gradi Celsius per 10 minuti a circa 60 inclinazioni al minuto.

Pre-inumidire una pipetta di plastica da 5 millilitri pipettando il tampone EDTA/HEPES/DPBS su e giù una volta, quindi utilizzare la pipetta pre-inumidita per triturare il tessuto e tamponare la sospensione 20 volte per rimuovere la mucosa epiteliale.

Raccogliere il tessuto versando la miscela attraverso un colino cellulare di nylon da 100 micron e utilizzare una pinza ad ago per posizionare il tessuto trattenuto nel colino in una nuova provetta da centrifuga conica da 50 millilitri contenente 30 millilitri di EDTA/HEPES/DPBS ghiacciato. Ripetere l'incubazione EDTA/HEPES/DPBS una seconda volta facendo oscillare il tessuto a 4 gradi Celsius per 10 minuti a circa 60 inclinazioni al minuto per rimuovere ulteriore mucosa epiteliale.

Eseguire una triturazione delicata utilizzando una pipetta da 5 millilitri preumidificata. Il tessuto tenderà ad attaccarsi all'interno della pipetta man mano che viene rimosso più epitelio.

A questo punto è necessaria una triturazione delicata, poiché le cellule gliali enteriche sono più fragili.

Raccogliere il tessuto dopo la seconda incubazione versando la miscela attraverso un colino cellulare di nylon da 100 micron e scartare il flusso. Il secondo flusso dovrebbe essere notevolmente meno torbido del primo. Ripetere le incubazioni di EDTA di 10 minuti fino a quando la soluzione è quasi limpida.

Trasferire il tessuto dal colino di nylon a una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri contenente 5 millilitri della soluzione di recupero cellulare disponibile in commercio. Quindi, oscilla per 25-30 minuti a 4 gradi Celsius. Triturare delicatamente 10 volte per dissociare le cellule gliali enteriche dalla lamina propria, quindi filtrare attraverso un filtro da 40 micron e raccogliere il filtrato in una provetta pulita da 50 millilitri.

Sciacquare il fazzoletto sul filtro di nylon con 1 millilitro di DPBS. Scartare il fazzoletto e trasferire i 5-6 millilitri di filtrato in una provetta da centrifuga conica pulita da 15 millilitri. Far girare il filtrato a 2.000 volte g in una centrifuga a secchiello oscillante per cinque minuti a 4 gradi Celsius.

Risospendere il pellet contenente cellule gliali in almeno 1 millilitro di tampone di risospensione pipettando delicatamente il pellet su e giù con il puntale della pipetta da 500 microlitri senza introdurre bolle. Infine, piastrate le cellule gliali enteriche aggiungendo 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita di laminina o 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente mezzi di crescita gliale.