Un metodo per l'isolamento delle unità neurovascolari dal cervello di ratto

Inizia con un mortaio di vetro freddo contenente tessuto cerebrale corticale di ratto, che è lo strato più esterno del cervello.

Aggiungere un tampone per microvasi cerebrali o BMB, contenente inibitori della proteasi.

Ora, muovi il pestello su e giù per dissociare il tessuto.

Questa agitazione rilascia le unità neurovascolari, o NVU, che comprendono microvasi, periciti, neuroni e cellule gliali. Gli inibitori della proteasi bloccano le proteasi rilasciate, proteggendo i microvasi.

Trasferite il composto in un tubo.

Aggiungere una soluzione polisaccaridica densa. Utilizzare un vortice per mescolare uniformemente la soluzione con altri contenuti.

centrifuga. I polisaccaridi densi consentono la sedimentazione delle NVU, che sono più dense dei detriti tissutali.

Scartare il surnatante e risospendere le NVU in BMB contenenti inibitore della proteasi e soluzione polisaccaridica.

Usa il vortice per mescolare il contenuto.

Ripetere il processo di centrifugazione. Eliminare il surnatante per rimuovere eventuali detriti residui.

Risospendere le NVU in BMB e memorizzarle per ulteriori analisi.

Metti il tessuto cerebrale corticale in un mortaio di vetro freddo. Quindi, aggiungere 5 millilitri di BMB con cocktail di inibitori della proteasi. Utilizzando un omogeneizzatore di potenza ad asta, inserire un pestello nel mortaio e omogeneizzare il tessuto cerebrale utilizzando 15 colpi su e giù a 3.700 giri/min. Quindi, versare l'omogeneizzato in provette da centrifuga etichettate. Tra un campione e l'altro, utilizzare etanolo al 70% per pulire il pestello.

Per eseguire la centrifugazione, aggiungere 8,0 millilitri di soluzione di destrano al 26% a ciascuna provetta da centrifuga etichettata contenente omogeneizzato cerebrale. Capovolgere il tubo due volte e quindi agitare accuratamente il campione. Condurre il vortice di ciascun campione utilizzando più angolazioni per garantire una miscelazione accurata della soluzione di omogeneizzato cerebrale con la soluzione di destrano al 26%. Centrifugare i campioni a 5.000 g e 4 gradi Celsius per 15 minuti.

Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5,0 millilitri di BMB con cocktail di inibitori della proteasi. Quindi, agitare il pellet per garantire una miscelazione accurata. Quindi, aggiungere 8,0 millilitri di destrano al 26% a ciascuna provetta da centrifuga e vortice come appena dimostrato. Quindi, centrifugare nuovamente i campioni.

Utilizzando un pallone sottovuoto e una pipetta di vetro, aspirare il surnatante e assicurarsi che il pellet contenente il microvaso cerebrale non venga danneggiato. Risospendere il pellet in BMB con l'inibitore della proteasi e poi destrano al 26% altre due volte. Dopo la centrifugazione finale, aggiungere 5,0 millilitri di BMB a ciascun pellet e vorticare per risospendere il campione.