Isolamento e coltura di periciti cerebrali di topo

Aggiungi un tampone al tessuto cerebrale del topo e omogeneizzalo per rilasciare cellule e microvasi.

Quindi, aggiungere la soluzione di BSA-destrano all'omogeneizzato. Mescolare e centrifugare per separare i componenti. Scartare il surnatante.

Risospendere i microvasi nel tampone e farli passare attraverso un filtro, rimuovendo i vasi più grandi.

A questo punto, centrifugare il filtrato e rimuovere il surnatante. Risospendere i microvasi in tampone contenente DNAses.

Aggiungere enzimi proteolitici per rilasciare cellule endoteliali e periciti.

Le DNasi degradano il DNA.

Aggiungere un tampone contenente BSA per interrompere l'attività enzimatica. Centrifugare ed eliminare il surnatante.

Risospendere le cellule in un terreno e piastrle su una piastra multipozzetto rivestita in matrice basamentale. Incubare, favorendo l'adesione cellulare.

Cambia regolarmente i media.

Le cellule endoteliali formano un monostrato e supportano la crescita dei periciti.

Il successivo passaggio delle cellule nei terreni pericitari su una piastra multipozzetto rivestita di gelatina promuove la crescita dei periciti eliminando le cellule endoteliali.

Inizia posizionando il cervello di un topo maschio C57 black 6 di età da quattro a sei settimane privo di agenti patogeni specifici su una salvietta sterile, asciutta e priva di lanugine e utilizzando una pinza a punta curva per rimuovere il cervelletto, lo striato e i nervi occipitale. Usa un batuffolo di cotone per rimuovere tutte le meningi visibili e capovolgi il tessuto cerebrale. Apri i lobi con leggeri movimenti verso l'esterno e rimuovi tutti i vasi sanguigni visibili. Quindi, posizionare il tessuto cerebrale privo di meningi in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 15 millilitri di tampone di lavaggio B freddo.

Per omogeneizzare il tessuto, trasferire il campione di cervello in una provetta di malta Dounce Tissue Grinder e aggiungere da 3 a 4 millilitri di tampone di lavaggio B alla provetta. Usa un pestello sciolto per tritare il fazzoletto 55 volte. Quindi, sciacquare il pestello con il tampone di lavaggio B e tritare il liquame di tessuto con un pestello stretto 25 volte. Al termine dell'omogeneizzazione, aliquotare equamente il liquame tra due provette da 50 millilitri e aggiungere 1,5 volte il volume di albumina di albumina bovina fredda al 30% di siero bovino. Quindi, agitare energicamente i tubi per mescolare l'impasto.

Per isolare la frazione vascolare, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e trasferire i surnatanti in due nuove provette. Conservare il pellet nel tampone di lavaggio B con ghiaccio. Risospendere i pellet in tre millilitri di Washing Buffer B a freddo su ghiaccio.

Centrifugare i surnatanti raccolti e ripetere ulteriormente questo passaggio ancora una volta. Scartare i surnatanti e risospendere i pellet in 3 millilitri di tampone di lavaggio B. Quindi, raggruppare i pellet risospesi e portare il volume finale delle sospensioni cellulari raggruppate a 10 millilitri con il tampone di lavaggio B fresco a freddo.

Inoltre, dissociare le cellule con una pipetta da 10 millimetri sei volte fino a quando non sono visibili grumi di pellet rimanenti e utilizzare un gruppo filtro sottovuoto e un filtro a rete di nylon per filtrare la sospensione cellulare. Posizionare il colino in una capsula di Petri e pulire la rete con il tampone di lavaggio B fresco e raschiando per recuperare eventuali capillari. Quindi, eseguire una seconda filtrazione con un filtro nuovo.

Dividere il filtrato in parti uguali tra due provette e raccogliere le celle mediante centrifugazione. Dopo aver scartato i surnatanti, riunire i pellet in un'unica provetta contenente il tampone di lavaggio B preriscaldato con enzimi e aggiungere la collagenasi dispasi preriscaldata alla provetta. Mettere il tubo in un bagno d'acqua per 33 minuti esatti a 37 gradi Celsius prima di interrompere la reazione con 30 millilitri di tampone di lavaggio freddo B.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e scartare con cura il surnatante. Risospendere rapidamente ma con attenzione il pellet nel tampone di lavaggio B sei volte e centrifugare nuovamente la sospensione. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in millilitri di terreno DMEM completo e seminare 2 millilitri di sospensione cellulare in DMEM completo in nove pozzetti di tre piastre a sei pozzetti rivestite da Matrigel.

Posizionare le colture cellulari in un incubatore sterile a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per 24 ore prima di rimuovere accuratamente i detriti da ciascun pozzetto e aggiungere terreni DMEM freschi. Dopo 48 ore, cambiare il terreno in ogni pozzetto ogni 48 ore. Il giorno 8-10, quando le cellule raggiungono la confluenza del 100%, far passare le cellule nel terreno di coltura del parassita su nuove piastre a sei pozzetti rivestite di gelatina e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altri 6-7 giorni con monitoraggio.