Una tecnica per ottimizzare la coltura di organoidi cerebrali utilizzando l'illuminazione laterale a luce soffusa
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:43 min • July 8th, 2025
Prendi una configurazione laterale di illuminazione a luce soffusa contenente una scheda acrilica dotata di pad bianchi e luci LED bianche installate su un bordo.
Posizionare davanti una piastra multipozzetto a bassa adesione contenente un terreno di formazione del corpo embrioide.
Aggiungi i corpi embrioidi, o EB, alla piastra.
La luce LED entra dal lato del pannello acrilico ed emette fasci paralleli, illuminando lateralmente gli EB e consentendo la visualizzazione ad occhio nudo.
Ruotare la piastra per indurre un flusso vorticoso, facendo convergere gli EB al centro.
Sostituire il terreno esaurito con un mezzo di formazione EB fresco.
Raccogliere gli EB utilizzando un puntale per pipetta a foro largo.
Tenere la pipetta in posizione verticale per consentire agli EB di depositarsi per gravità.
Trasferisci gli EB su un'altra piastra a bassa aderenza contenente un mezzo di induzione neurale.
Toccare la punta a metà. Gli EB affondano a causa della tensione superficiale del liquido.
Fattori specifici nel mezzo avviano la differenziazione neurale negli EB, formando uno strato neuroepiteliale.
Usa una lavagna acrilica trasparente con uno spessore da 0,3 a 0,5 centimetri nel formato di un foglio A5 e incolla i tamponi bianchi sulla parte anteriore e posteriore della lastra acrilica. Quindi, installa una fila di luci bianche a LED sul bordo della piastra in modo che le luci possano entrare dal lato della lastra acrilica e quindi sparare in parallelo.
Ora, preparare una nuova piastra a sei pozzetti a bassa adesione e aggiungere 2 millilitri di terreno di formazione EB a ciascun pozzetto. Dopo aver rimosso gli EB insieme al terreno, utilizzando il puntale per pipetta a foro largo da 1000 microlitri, trasferire circa 100 EB per pozzetto nella piastra a 6 pozzetti a bassa aderenza.
Per sostituire ogni giorno il mezzo di formazione EB con lo stesso volume di terreno fresco, indurre un flusso a vortice ruotando la capsula lungo un'orbita circolare. Gli EB o organoidi convergono al centro del pozzetto a causa del flusso secondario generato attraverso la rotazione. Aspirare lentamente il vecchio terreno pipettandolo fino al bordo del pozzetto. Non aspirare troppo forte, altrimenti gli EB verranno rimossi insieme. Quindi, aggiungere nuovi supporti per risospendere gli EB.
Per l'induzione neurale, preparare una nuova piastra a 6 pozzetti a bassa aderenza con 3 millilitri di terreno di induzione neurale per pozzetto. Accendi la luce soffusa laterale e spegni le altre fonti di luce interna. A questo punto, trasferire gli EB sulla piastra a 6 pozzetti con l'aggiunta di un mezzo di induzione neurale utilizzando una punta di pipetta a bocca larga per aspirare sia gli EB che il terreno di coltura. Quindi, tenere la pipetta in posizione verticale. Gli EB affonderanno gradualmente per gravità e convergeranno verso la bocca del puntale della pipetta.
Quando la bocca del puntale della pipetta tocca nuovamente la superficie del liquido e, a causa della tensione superficiale del liquido, gli EB affondano rapidamente nel fluido. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Panoramica
Questo articolo illustra una tecnica di illuminazione laterale con luce soffusa progettata per migliorare la visualizzazione e la manipolazione dei corpi embrioidi (EB) durante la coltura di organoidi cerebrali. Il protocollo descrive l'allestimento del sistema di illuminazione, le procedure per il cambio del mezzo, il trasferimento dei corpi embrioidi e l'induzione della differenziazione neurale, facilitando uno sviluppo efficiente degli organoidi cerebrali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia delle cellule staminali
- Neuroscienze
- Tecnologia degli organoidi
Sfondo
- Gli organoidi cerebrali sono modelli preziosi per lo studio dello sviluppo e delle malattie del cervello umano.
- La manipolazione e il trasferimento degli EB possono risultare difficili a causa della scarsa visibilità nelle condizioni di coltura standard.
- Tecniche di visualizzazione migliorate possono aumentare l'efficienza e la riproducibilità dei protocolli di coltura degli organoidi.
- L'illuminazione laterale con luce diffusa offre una soluzione semplice ed economica per un'osservazione migliore ad occhio nudo degli EB.
Scopo dello studio
- Introdurre e convalidare un sistema di illuminazione laterale soffusa per migliorare la visualizzazione degli EB.
- Facilitare la manipolazione e il trasferimento degli EB durante la coltura di organoidi cerebrali.
- Fornire un protocollo passo dopo passo per il cambio del mezzo e l'induzione neurale utilizzando questo metodo di illuminazione.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di una piastra in acrilico con cuscinetti bianchi e luci LED bianche montate ai bordi per l'illuminazione laterale.
- Coltura di EB in piastre multi-well a bassa adesione con mezzo di formazione degli EB.
- Cambi giornalieri del mezzo utilizzando un flusso a vortice per centralizzare gli EB e una pipettatura accurata per evitare perdite.
- Trasferimento degli EB in mezzo di induzione neurale mediante punte di pipetta a largo foro, facilitato dall'allestimento di illuminazione.
- Incubazione degli EB per la differenziazione neurale a 37°C e 5% CO2.
Risultati principali
- L'illuminazione laterale soffusa migliora significativamente la visualizzazione ad occhio nudo degli EB nelle piastre di coltura.
- La tecnica consente una manipolazione e un trasferimento degli EB più precisi ed efficienti.
- Un flusso a vortice e un'accurata pipettaggio permettono cambi efficaci del mezzo senza perdita di EB.
- L'induzione neurale degli EB procede con successo, portando alla formazione di uno strato neuroepiteliale.
Conclusioni
- L'illuminazione laterale con luce soffusa è un metodo pratico ed efficace per facilitare la coltura di organoidi cerebrali.
- L'approccio migliora la visualizzazione, la manipolazione e il trasferimento degli EB, aumentando l'efficienza del flusso di lavoro.
- Questa tecnica può essere facilmente adottata nei laboratori che lavorano con sistemi di organoidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione dei corpi embrionoidi (EB) durante le prime fasi di differenziazione rappresenta un collo di bottiglia nella scoperta di farmaci e nella validazione di bersagli basati sulle cellule staminali. L'illuminazione laterale soffusa consente il monitoraggio ad occhio nudo dell'aggregazione e della manipolazione dei EB, migliorando la riproducibilità nei protocolli di induzione neurale. Questo approccio supporta la riduzione dei rischi meccanicistici fornendo un metodo semplice e scalabile per valutare in vitro i fenotipi neurosviluppamentali precoci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'osservazione diretta della formazione e dell'aggregazione degli EB, supportando la verifica di ipotesi nella differenziazione delle cellule staminali pluripotenti.
- Valore operativo: Riduce la dipendenza da sistemi di imaging complessi per il monitoraggio routinario degli EB durante la manutenzione della coltura.
- Valore predittivo: Facilita il rilevamento precoce della competenza differenziativa, contribuendo alla validazione degli obiettivi nelle vie dello sviluppo neurologico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Standardizza la manipolazione e il trasferimento dei corpi embrionoidi, migliorando la coerenza nei setup di screening di composti mediante modelli basati su corpi embrionoidi.
- Output quantitativo: Permette il recupero e la semina riproducibili dei corpi embrionoidi, supportando dosaggi e letture standardizzati nello screening fenotipico.
- Scalabilità: Compatibile con formati a piastre multipozzetto, consentendo l'elaborazione in parallelo di popolazioni di corpi embrionoidi per l'ottimizzazione dei saggi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Permette la generazione di strati neuroepiteliali da corpi embrionali, fornendo un sistema rilevante per la malattia utile alla modellizzazione preclinica precoce.
- De-risking Meccanicistico: Consente la conferma visiva del progresso dell'induzione neurale, riducendo l'ambiguità sull'efficienza della differenziazione prima delle applicazioni successive.
- Allineamento dei Biomarcatori: Permette il campionamento tempestivo di corpi embrionali differenziati per l'analisi dei biomarcatori negli studi sulla modulazione dei percorsi dello sviluppo neurologico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si integra nel percorso di scoperta, dalla coltura delle cellule staminali fino alla differenziazione neurale precoce, sostenendo le fasi di identificazione del composto promettente e di validazione preclinica.
- Biologia della scoperta Migliora il test delle ipotesi consentendo la visualizzazione in tempo reale del comportamento degli EB durante il cambio e il trasferimento del mezzo.
- Screening: Migliora la riproducibilità del saggio standardizzando la concentrazione e il trasferimento dell'EB mediante flusso vorticoso e pipettaggio basato sulla gravità.
- Analitica: Fornisce popolazioni di EB consistenti per l'analisi successiva, migliorando la comparabilità dei dati tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale Supporta la generazione di strati neuroepiteliali, collegando la differenziazione in vitro con modelli preclinici di sviluppo neurologico.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma economica e riutilizzabile per la coltura routinaria di EB in diverse linee di cellule staminali e protocolli di differenziamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nei risultati della differenziazione consentendo il monitoraggio visivo della morfologia degli aggregati embrionali e del loro grado di aggregazione.
- Valore operativo: Semplifica il flusso di lavoro con un equipaggiamento minimo—una lastra in acrilico, luci LED e piastre a bassa adesività—riducendo la variabilità tecnica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione nelle fasi iniziali della differenziazione fornendo criteri osservabili del successo dell’induzione neurale.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei ceppi di cellule staminali adeguata al rischio, basata sulla competenza degli aggregati embrionali e sul grado di prontezza alla differenziazione, entrambi visibili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base nella coltura di cellule staminali e familiarità con superfici a bassa adesività per prevenire l'attaccamento degli EB.
- Richiede l'accesso a luci LED bianche e tavolette acriliche trasparenti per l'allestimento dell'illuminazione laterale.
- Necessita di una tecnica standardizzata di flusso a vortice per evitare la perdita di EB durante il cambio del mezzo.
- Deve essere adattata a diverse dimensioni di EB e volumi di coltura quando si scala tra diversi formati di pozzetti.
- Limitato a campioni traslucidi; l'efficacia può diminuire con colture di organoidi densi o pigmentati.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026