Isolamento di oligodendrociti primari murini mediante microsfere immunomagnetiche

Prendi una sospensione di cellule neurali, inclusi oligodendrociti immaturi e cellule neuronali primarie, da un cucciolo di topo.

Risospendere le cellule in un tampone di smistamento magnetico per evitare l'aggregazione delle cellule.

Aggiungi microsfere magnetiche ingegnerizzate che trasportano anticorpi anti-O4 sulla loro superficie. Agitare la soluzione per garantire una miscelazione uniforme.

Incubare per consentire alle microsfere di legarsi con il galattolipidide solfato, un antigene O4 sugli oligodendrociti, mentre le altre cellule rimangono non legate o debolmente legate.

Lavare la miscela con un ulteriore tampone di selezione delle cellule.

Centrifugare e scartare il surnatante, quindi risospendere le cellule.

Successivamente, passare le celle legate a perline in una colonna di separazione magnetica dotata di un filtro che rimuove i grumi di cellule più grandi.

Durante la corsa, sotto un campo magnetico, i complessi legati alle perle si muovono verso il magnete, attaccandosi ai lati.

Lavare per rimuovere le cellule non legate e quelle debolmente legate.

Recuperare la colonna dal separatore e lavarla con un mezzo di proliferazione per raccogliere gli oligodendrociti primari per applicazioni future.

Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in 90 microlitri di tampone magnetico fresco per 1 x 10⁷ cellule. Quindi, aggiungere 10 microlitri di perle anti-O4 per 1 x 10⁷ celle e mescolare la soluzione cellulare con un leggero colpo. Dopo 15 minuti a 4 gradi Celsius, con un leggero sfioramento, ogni 5 minuti, aggiungere delicatamente 2 millilitri di tampone magnetico per la selezione delle cellule per 1 x 10⁷ celle per un lavaggio mediante centrifugazione e scartare il surnatante con un'attenta aspirazione sotto vuoto.

Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone magnetico di selezione delle cellule fresco per ogni 1 x 10⁷ celle e posizionare una colonna di selezione delle microsfere magnetiche di dimensioni adeguate nel separatore magnetico corrispondente. Posizionare un filtro da 40 micron sulla colonna e pre-risciacquare il filtro con 3 millilitri di tampone magnetico per la selezione delle cellule, lasciando che il tampone scorra attraverso la colonna senza lasciare che la colonna si asciughi. Aggiungere le cellule al colino, quindi un lavaggio da 1 millilitro con tampone magnetico per la selezione delle cellule.

Lavare la colonna tre volte con 3 millilitri di tampone magnetico per smistamento cellulare per lavaggio e una volta con terreno di proliferazione degli oligodendrociti. Quindi, trasferire la colonna in una provetta da 15 millilitri e utilizzare lo stantuffo per far fluire immediatamente 5 millilitri di terreno di proliferazione degli oligodendrociti freschi attraverso la colonna.