Isolamento delle cellule di Schwann dalle radici spinali del topo

Prendete una radice nervosa e tagliatela a pezzetti.

Trasferire in una provetta contenente enzimi digestivi e incubare.

L'enzima digerisce la matrice extracellulare.

Aggiungere terreni contenenti siero per fermare la digestione.

Pipettare ripetutamente il contenuto, quindi centrifugare ed eliminare il surnatante.

Risospendere il pellet.

Passare la sospensione attraverso un colino per rimuovere il tessuto non digerito. Incubare le cellule raccolte in una piastra.

I fibroblasti e le cellule di Schwann o SC si attaccano alla piastra e si dividono.

Rimuovere le celle non collegate. Lavare le cellule attaccate con un tampone fosfato.

Aggiungi enzimi digestivi per sciogliere le SC sensibili alla digestione. Arresta la digestione con i media.

Scollega completamente gli SC aggiungendo file multimediali.

Trasferire le cellule in una provetta e centrifugare. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in terreni specifici per SC.

Trasferire le cellule in una piastra non rivestita e incubare.

Eventuali fibroblasti rimanenti aderiranno, lasciando le SC in sospensione.

Trasferire la sospensione su una piastra rivestita di matrice.

Incubare per l'attacco e la divisione delle cellule di Schwann.

Taglia i nervi in pezzi da 3 a 5 millimetri con le forbici. Aggiungere 1 millilitro di tripsina allo 0,25% e trasferire i pezzi nervosi in provette da centrifuga da 5 millilitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 18-20 minuti. Successivamente, per fermare la digestione, aggiungere da 3 a 4 millilitri di DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino. Pipettare delicatamente la miscela su e giù, circa 10 volte. Centrifugare a 800 volte g per 5 minuti.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il precipitato in 2 o 3 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 400 mesh, quindi utilizzare la sospensione per inoculare una piastra di Petri da 60 millimetri. Incubare le piastre di Petri per 4-5 giorni a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica.

Quando la coltura ha raggiunto il 90% di confluenza, lavare le cellule una volta utilizzando 1X PBS. Quindi, per digerire le cellule di Schwann, aggiungere 1 millilitro di tripsina allo 0,25% a 37 gradi Celsius per piatto da 60 millimetri. Dopo 8-10 secondi a temperatura ambiente, interrompere la digestione aggiungendo 3 millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS. Per staccare le cellule di Schwann, soffiare delicatamente sulle cellule con una pipetta.

Verificare al microscopio che le cellule siano staccate. Quindi, raccogliere il terreno, che contiene le cellule di Schwann, e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il precipitato in 3 millilitri di terreno. Utilizzare la sospensione per inoculare piastre di Petri da 60 millimetri non codificate e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti. Trasferire il terreno, che conterrà le cellule di Schwann in un piatto medio rivestito di poli-L-lisina, e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per 2 giorni.