Marcatura dei marcatori di superficie delle cellule neurali con Azidosugar durante la co-coltura con le cellule endoteliali

Iniziare aggiungendo una sospensione di cellule endoteliali cerebrali di topo all'inserto della membrana permeabile di una piastra transwell.

Aggiungere un terreno di coltura sul fondo e incubare.

I fattori di crescita e le sostanze nutritive nel terreno aiutano le cellule a crescere come un monostrato.

Rimuovere il fluido dal pozzetto inferiore e dall'inserto.

Lavare le superfici interne ed esterne dell'inserto per rimuovere eventuali detriti.

Aggiungere un terreno aderente all'inserto e trasferire l'inserto in un pozzetto rivestito di matrice contenente cellule staminali neurali corticali primarie e cellule progenitrici, o NSPC, e incubare.

Aggiungere azidosugar, un analogo innaturale del precursore dell'acido sialico, sia alle cellule endoteliali che alle NSPC, e incubare.

Le citochine e le chemochine secrete dalle cellule endoteliali promuovono la crescita delle NSPC in grandi cloni simili a fogli.

Gli azidozuccheri si integrano nelle strutture sialoglycan sulla superficie cellulare NSPC, marcando la glicoproteina. Ciò consente l'identificazione delle proteine della superficie cellulare sulle NSPC espanse.

Per preparare le cellule endoteliali, risospendere un pellet di cellule BEND3 da una capsula di Petri di 0,10 centimetri al 90% di confluenza con 9 millilitri di terreno cellulare BEND3. Aggiungere 1 millilitro di sospensione cellulare in un inserto di supporto permeabile. Aggiungere altri 2 millilitri di terreno BEND3 per pozzetto nella camera inferiore della matrice. Continuare a coltivare le cellule per un giorno a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Un giorno dopo aver placcato le cellule negli inserti, aspirare delicatamente il terreno, prima dalla camera inferiore e poi dagli inserti. Lavare la parte anteriore degli inserti tre volte con DMEM preriscaldato. Lavare la superficie esterna degli inserti risciacquando con DMEM preriscaldato. Quindi, aggiungi 1 millilitro di AM preriscaldato in un inserto. Trasferire gli inserti nei pozzetti con le cellule corticali primarie. Incubare la co-coltura a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 12 ore.

Sciogliere Ac₄ManNAz in DMSO per ottenere una concentrazione stock di 200 millimolari. Recuperare la piastra di co-coltura endoteliale neurale dall'incubatrice. Aggiungere 1 microlitro di stock Ac₄ManNAz in ciascuna camera inferiore e 0,5 microlitri per inserto nella co-coltura. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 5 giorni. Mentre le cellule sono in coltura, aggiungere 100 microlitri di RM per inserto e 200 microlitri di RM per camera inferiore per rialimentare le cellule endoteliali e neurali a giorni alterni.