JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:27 min • July 8th, 2025
Prendi una coda bovina.
Rimuovere il tessuto sovrastante e i processi vertebrali, quindi tagliare trasversalmente per ottenere segmenti.
Identificare il disco intervertebrale o IVD, situato tra le placche di crescita e le placche terminali vertebrali.
Tagliare su entrambi i lati dell'IVD e metterlo in un piatto contenente una garza imbevuta di tampone per mantenere la vitalità dei tessuti.
Raschiare via il tessuto vertebrale attaccato e misurare l'altezza dell'IVD.
Lavare con un tampone per rimuovere i residui di sangue e disinfettare l'IVD in un tampone contenente antibiotici.
Collocare gli IVD in camere di bioreattore contenenti terreni.
Il terreno nel gruppo fisiologico ha un alto livello di glucosio, mentre nel gruppo patologico, un mezzo a basso contenuto di glucosio induce la privazione di nutrienti.
Posizionare le camere nel bioreattore.
Per l'IVD fisiologico, applicare un carico delicato ogni giorno. Per l'IVD patologico, applicare un carico intenso a una velocità più elevata ogni giorno.
Tra i test di carico giornalieri, consentire agli IVD di riprendersi nel terreno.
Dopo tutte le procedure di carico, misurare le altezze dell'IVD.
Un'altezza ridotta negli IVD patologici indica una condizione degenerativa e pro-infiammatoria.
Inizia sciacquando accuratamente l'intera coda bovina con acqua di rubinetto per rimuovere lo sporco e i peli sulla superficie. Quindi, immergere la coda in una soluzione di betadine all'1% per 10 minuti per disinfettare la superficie. Utilizzare un bisturi numero 20 per rimuovere i tessuti molli dalla colonna vertebrale caudale per facilitare l'identificazione dei dischi intervertebrali o IVD.
Rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre con una pinza per la rimozione dell'osso. Tagliare trasversalmente con una pinza ossea attraverso il centro di ciascun corpo vertebrale per ottenere singoli segmenti di movimento, quindi mettere i segmenti di movimento raccolti in una capsula di Petri con una garza bagnata nella soluzione di Ringer.
Localizzare l'IVD e le vertebre muovendo delicatamente i segmenti di movimento. Quindi, identifica la posizione della cartilagine di accrescimento toccando e trovando il lato convesso della placca terminale ossea. Raffreddare la lama della sega a nastro con la soluzione di Ringer e utilizzarla per eseguire due tagli paralleli nella placca di crescita degli IVD, uno su ciascun lato.
Trasferire gli IVD in una capsula di Petri pulita con una garza pulita bagnata con la soluzione di Ringer. Raschiare il corpo vertebrale e la cartilagine di accrescimento utilizzando la lama del bisturi, lasciando intatta la placca terminale. Posizionare le due superfici piane e parallele per la procedura di caricamento e trasferire gli IVD raschiati in una capsula di Petri fresca con una garza bagnata con la soluzione di Ringer.
Misurare l'altezza e il diametro del disco con un calibro. Quindi, pulire i coaguli di sangue nell'osso delle vertebre con la soluzione di Ringer utilizzando un sistema di lavaggio a getto. Disinfettare gli IVD in PBS e penicillina-streptomicina al 10%, agitando per 15 minuti. Sciacquare gli antibiotici ad alta concentrazione con PBS e penicillina streptomicina all'1%.
Trasferire i dischi nelle camere IVD contenenti 5 millilitri di terreno di coltura IVD e posizionarli nel sistema del bioreattore con un incubatore a 37 gradi Celsius con l'85% di umidità e il 5% di anidride carbonica. Coltivare i dischi per quattro giorni all'interno di un sistema di bioreattori mantenendo diverse condizioni di carico a seconda dei gruppi sperimentali.
Nel gruppo di controllo fisiologico, coltivare gli IVD con un alto livello di glucosio utilizzando un protocollo di carico da 0,02 a 0,2 megapascal e 0,2 Hertz per due ore al giorno. Nel gruppo patologico, coltivare gli IVD con un mezzo a basso contenuto di glucosio utilizzando un protocollo di carico da 0,32 a 0,5 megapascal e 5 Hertz per due ore al giorno.
Tra una procedura di carico e l'altra, posizionare gli IVD in piastre a sei pozzetti con 7 millilitri di terreno di coltura IVD per il recupero libero del rigonfiamento. Misurare l'altezza del disco giornalmente con un calibro dopo il periodo di rigonfiamento libero e dopo il carico dinamico per la durata dell'esperimento.