Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in una popolazione di neuroni in rete

Seminare cellule staminali embrionali di topo in un piatto a basso attaccamento contenente mezzi di differenziazione.

Incubare a rotazione per facilitare l'aggregazione cellulare e la differenziazione in una linea neuronale.

Trasferire gli aggregati in un tubo e lasciarli sedimentare per gravità. Eliminare il supporto.

Risospendere e trasferire gli aggregati nel piatto originale contenente mezzi di differenziazione integrati con acido retinoico.

L'acido retinoico induce l'espressione genica neuronale, innescando la differenziazione in cellule progenitrici neurali.

Trasferire gli aggregati in un tubo. Rimuovere il terreno e aggiungere la tripsina per dissociare gli aggregati.

Aggiungere un inibitore per neutralizzare la tripsina.

Pipettare ripetutamente per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Filtrare la sospensione per rimuovere gli aggregati.

Centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le celle nel terreno.

Semina le cellule su un piatto rivestito di polimero per facilitare l'adesione cellulare.

Rimuovere il supporto. Aggiungere nuovi terreni contenenti fattori di crescita per promuovere la maturazione neuronale e formare una popolazione di neuroni in rete.

La differenziazione delle ESC in neuroni inizia durante un passaggio cellulare di routine. Dissociare le ESC come prima, ma includere una piastra aggiuntiva per la differenziazione neuronale. Trasferire 350 microlitri della sospensione cellulare in un piatto a basso attacco di 10 centimetri contenente 25 millilitri di terreno di differenziazione.

Posizionare la piastra su un agitatore orbitale impostato a 30-45 giri/min all'interno di un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e incubare per 48 ore. Dopo 48 ore, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per trasferire gli aggregati cellulari di differenziazione in una provetta conica da 50 millilitri.

Subito dopo, aggiungere 25 millilitri di terreno di differenziazione fresco alla piastra di Petri. Lasciare che gli aggregati si depositino per due o cinque minuti, producendo un pellet visibile profondo uno o due millimetri. Aspirare con cura il terreno, ignorando eventuali singole cellule o piccoli aggregati ancora in sospensione, e utilizzare una pipetta P1000 per trasferire nuovamente il pellet di cellule nella piastra di Petri. Rimettere la piastra nello shaker rotante nell'incubatrice. Dopo altre 48 ore, ripetere la procedura di sostituzione del supporto. Questa volta, aggiungere 30 millilitri di terreno di differenziazione integrato con sei micromolari di acido retinoico all-trans.

Il pellet formato sarà ora profondo da due a quattro millimetri. Dopo aver incubato le cellule come prima, ripetere per l'ultima volta la procedura di cambio del terreno con l'integrazione di acido retinoico. A questo punto il pellet avrà una profondità compresa tra quattro e otto millimetri.

Il giorno seguente, preparare le superfici di placcatura come indicato nella parte scritta del protocollo. Nel pomeriggio del giorno della placcatura, scongelare 5 millilitri ciascuno di terreno di tripsinizzazione NPC pre-aliquotato e inibitore della tripsina di soia allo 0,1% a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per trasferire gli aggregati differenzianti dalla piastra di coltura a una provetta conica da 50 millilitri.

Lasciare riposare gli aggregati per tre-cinque minuti, quindi aspirare con cura il fluido senza disturbare il pellet. Successivamente, lavare il pellet con 5-10 millilitri di PBS e, dopo che gli aggregati si sono depositati, aspirare il PBS e ripetere il lavaggio. Dopo il secondo lavaggio PBS, aggiungere 5 millilitri di terreno di tripsinizzazione NPC al pellet e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti, muovendo delicatamente il tubo due o tre volte durante l'incubazione.

Successivamente, aggiungi 5 millilitri di inibitore della tripsina di soia allo 0,1% alle cellule e mescola rapidamente invertendolo. Quindi, triturare delicatamente le cellule da 10 a 15 volte con una pipetta da 10 millilitri fino a produrre una sospensione cellulare relativamente omogenea. Filtrare lentamente la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 o 70 micron posizionato sopra un tubo conico da 50 millilitri.

Quindi, una volta che tutta la sospensione è stata filtrata, aggiungere 1 millilitro di terreno N2 al filtro per lavare le celle rimanenti attraverso il colino. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare per sei minuti a 200 volte g.

Dopo aver aspirato il terreno, senza disturbare il pellet, triturare in 2 millilitri di terreno N2, quindi aggiungere il terreno N2 per un volume totale di 10 millilitri. Centrifugare per cinque minuti a 200 volte g. Aspirare il mezzo e ripetere il processo di lavaggio del pellet, di nuovo, risospendendo il pellet in 10 millilitri di terreno N2.

Rimuovere un'aliquota delle cellule, contare con un emocitometro, quindi ripetere la centrifugazione. Risospendere le cellule in terreno N2 a una concentrazione finale di 1x volte 10⁷ cellule per millilitro, e impiattare a una densità compresa tra 150.000 e 200.000 cellule per centimetro quadrato in piatti preparati a DIV meno 1 e collocare nell'incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius. Mantenere gli ESN secondo le istruzioni nel protocollo scritto.