JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:19 min. • July 8th, 2025
Prelevare una sospensione di cellule e detriti dalle fibre del nervo sciatico di topo digerite enzimaticamente.
Passare attraverso un colino, rimuovendo i detriti.
Centrifugare il filtrato e rimuovere il surnatante.
Risospendere le cellule in terreni contenenti siero e seminarle su una piastra di coltura rivestita di proteine di adesione.
Incubare per l'adesione cellulare. Sostituire i supporti con i supporti cellulari Schwann. Incubare per la formazione del monostrato di cellule di Schwann.
Rimuovere il supporto e lavare con tampone. Incubare con tripsina per staccare le cellule.
Aggiungere terreni contenenti siero per fermare l'attività enzimatica.
Raccogliere le celle e centrifugare. Scartare il surnatante.
Risospendere le cellule nel tampone e aggiungere microsfere magnetiche rivestite di anticorpi.
Incubare per legare gli anticorpi alle glicoproteine dei fibroblasti.
Centrifugare ed eliminare il surnatante. Risospendere le celle in tampone e caricarle in una colonna di separazione magnetica contenente sfere ferromagnetiche poste nel campo magnetico del separatore magnetico.
Il campo magnetico trattiene i fibroblasti legati alle microsfere, consentendo la raccolta delle cellule di Schwann nel flusso.
Trasferire i nervi digeriti in una provetta da 50 millilitri per centrifugare a 188 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 microgrammi per millilitro di gentamicina.
Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri. Dopo aver centrifugato a 188 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius, risospendere il pellet con 4 millilitri di DMEM contenente FCS e gentamicina. Aggiungere 2 millilitri di sospensione cellulare a ciascuna delle due piastre di coltura tissutale da 60 millimetri rivestite di poli-L-lisina e laminina. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, lasciando intatte le piastre per 2 giorni nell'incubatore.
Centrifugare la sospensione cellulare di Schwann a 188 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius e risospendere il pellet di cella in 90 microlitri di tampone magnetico di separazione cellulare per 1 x 107 cellule. Quindi, aggiungere 10 microlitri di microsfere Thy-1 per 1 x 107 cellule. Incubare la soluzione risospesa per 15 minuti al buio a 8 gradi Celsius.
Quindi, aggiungere 2 millilitri di tampone magnetico di separazione cellulare alla sospensione cellulare. Dopo aver centrifugato a 300 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius, risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di separazione a celle magnetiche. Posizionare la colonna di separazione magnetica delle celle nel separatore di celle e inumidire la colonna con 1 millilitro del tampone di separazione magnetica delle cellule. Quindi, applica le celle per raccogliere il flusso.