Una tecnica per isolare nuclei da cellule non neuronali nel giro dentato dell'ippocampo

Prelevare il giro dentato dal cervello di un topo in un tampone di omogeneizzazione a freddo.

Dissociarsi meccanicamente per rilasciare neuroni, glia e cellule staminali.

Il detergente delicato del tampone permeabilizza le cellule, rilasciando nuclei e altri organelli.

Filtrare l'omogeneizzato per rimuovere i detriti tissutali. Quindi, centrifugare, rimuovere gli organelli e risospendere nel tampone di omogeneizzazione per lisare le cellule intatte.

Centrifugare di nuovo, rimuovere il surnatante contenente gli organelli rilasciati e risospendere i nuclei in un tampone di lavaggio.

Filtrare per rimuovere eventuali detriti, centrifugare e rimuovere il surnatante.

Introdurre una colorazione fluorescente del DNA per marcare tutti i nuclei e un anticorpo coniugato con fluorofori che si lega all'antigene nucleare neuronale, o NeuN, marcando i nuclei dei neuroni.

Utilizzando lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza, è possibile identificare gli aggregati con una maggiore intensità di fluorescenza della colorazione del DNA e proprietà di dispersione più elevate, separando i singoli nuclei.

Analizzare i singoli nuclei, separando i nuclei neuronali NeuN-positivi e isolando i nuclei NeuN-negativi appartenenti alla glia e alle cellule staminali.

Omogeneizzare il tessuto con 10 colpi del pestello A sciolto, seguiti da 15 colpi del pestello B stretto. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 millilitri pre-raffreddata. Sciacquare l'omogeneizzatore Dounce con 1 millilitro di HB freddo e unirlo allo stesso tubo.

Aggiungere 3 millilitri di HB alla provetta da 15 millilitri e incubare per 5 minuti con ghiaccio. Mescolare due volte questa sospensione di nuclei capovolgendo delicatamente il tubo. Utilizzando 0,5 millilitri di HB, pre-bagnare il tappo del filtro da 70 micrometri posizionato su una provetta da 50 millilitri. Quindi, filtrare la sospensione dei nuclei prima di lavare il filtro cellulare con 0,5 millilitri di HB.

Quindi, rimuovere il filtro cellulare e centrifugare la provetta in una centrifuga a secchio oscillante a 500 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet in 4 millilitri di HB utilizzando una pipetta P1000.

Dopo cinque minuti di incubazione con ghiaccio, centrifugare la sospensione a 500 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 millilitri di mezzo di lavaggio. Utilizzare 0,5 millilitri di liquido di lavaggio per pre-inumidire un tappo del filtro da 35 micrometri su una provetta da 50 millilitri. Quindi, filtrare la sospensione dei nuclei pipettando 0,5 millilitri di sospensione alla volta utilizzando la pipetta P1000.

Dopo aver lavato il tappo del filtro con 0,5 millilitri di liquido di lavaggio, posizionare il tubo sul ghiaccio. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da 15 millilitri e centrifugarlo per 5 minuti e 4 gradi Celsius a 500 g. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 millilitri di mezzo di lavaggio.

Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet in 1 millilitro di terreno di lavaggio con l'anticorpo coniugato anti-Neu e AlexaFlour488 di topo e 1 microgrammo per millilitro di DAPI. Incubare la reazione per 45 minuti su ghiaccio al buio.

Per lo smistamento dei nuclei attivati da fluorescenza o FANS, trasferire la sospensione di nuclei immunocolorati in una provetta da 5 millilitri e posizionarla sul ghiaccio fino all'inizio della procedura di citometria a flusso.

Agitare i campioni per tre secondi con intensità lieve prima di inserire le provette nello strumento FACS.

Per acquisire i dati dalla sospensione dei nuclei di colorazione, impostare i gate in altezza DAPI e nell'area DAPI per escludere i detriti cellulari e i nuclei aggregati. Quindi, impostare i cancelli nell'area di dispersione laterale del log o SSC e nell'area di dispersione in avanti del log o FSC per separare i singoli nuclei dall'aggregato o dai detriti cellulari colorati con DPI rimanenti.

Quindi, isolare la popolazione NeuNAF488-negativa impostando i cancelli per l'area anti-NeuNAF488 e FSC.

Dopo l'analisi, selezionare la popolazione anti-NeuNAF488-negativa in una provetta di raccolta da 1,5 millilitri riempita con 50 microlitri di terreno di lavaggio utilizzando la strategia di gating.