Isolamento della microglia da lesioni demielinizzanti del cervello di topo mediante smistamento cellulare attivato magneticamente

Sezionare le lesioni demielinizzanti colorate dal corpo calloso del cervello di un topo.

Queste lesioni contengono microglia residenti nel cervello che esprimono l'integrina CD11b sulla superficie cellulare.

Raccogliere il tessuto e aggiungere una soluzione contenente un enzima proteolitico e DNasi.

L'enzima degrada la matrice extracellulare, mentre la DNasi degrada il DNA libero.

Aggiungere un tampone freddo e filtrare la sospensione attraverso un colino per rimuovere i grumi cellulari.

Centrifugare, scartare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in un mezzo a gradiente di densità.

Sovrapposizione con tampone e centrifuga per raccogliere i detriti rimanenti negli strati superiori; le cellule intatte si depositano sul fondo.

Rimuovere i detriti e risospendere le celle in un tampone.

Aggiungere perline magnetiche anti-CD11b per etichettare la microglia.

Caricare le celle su una colonna contenente sfere ferromagnetiche poste nel campo magnetico del separatore magnetico.

Sotto il campo magnetico esterno, le microglia legate a perle vengono trattenute nella colonna mentre le cellule non legate fluiscono attraverso.

Rimuovere la colonna dal campo magnetico. Aggiungere un tampone per eluire la microglia.

Inizia con la microdissezione delle lesioni marcate da un colorante neutro attorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio. Centrifugare il tessuto sezionato a 300 x g per 30 secondi per raccogliere il campione sul fondo della provetta. Preriscaldare la miscela enzimatica 1 e la miscela enzimatica da 2 a 37 gradi Celsius in un incubatore. Quindi, aggiungere 1.950 microlitri di miscela enzimatica preriscaldata, 1 in un campione e digerire in un incubatore a 37 gradi Celsius per 5 minuti. Aggiungere 30 microlitri di miscela enzimatica 2 preriscaldata e mescolare delicatamente.

Dopo la digestione, aggiungere 4 millilitri di PBS freddo al tubo e agitare delicatamente. Centrifugare i campioni di tessuto a 300 x g per 10 minuti a 4 gradi Celsius e aspirare il surnatante lentamente e completamente. Risospendere delicatamente il pellet cellulare con 1.550 microlitri di PBS freddo. Aggiungere 450 microlitri di soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolarli bene.

Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per sovrapporre il composto molto lentamente e delicatamente, con 2 millilitri di PBS freddo. Centrifugate, il composto e poi cercate i 3 strati. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per aspirare completamente i 2 strati superiori e riempire la provetta fino a 5 millilitri con tampone di caricamento freddo. Capovolgere delicatamente il tubo 3 volte.

Successivamente, dopo la centrifugazione e l'aspirazione del surnatante, risospendere il pellet cellulare con 90 microlitri di tampone di caricamento e aggiungere 10 microlitri di perle CD11b. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo l'incubazione aggiungere 1 millilitro di tampone di caricamento e lavare le cellule pipettando delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1000 microlitri.

Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a 4:00 gradi Celsius e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate. Risospendere le celle in 500 microlitri del tampone di carico e posizionare la colonna MS con il suo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico. Sciacquare la colonna con 500 microlitri del tampone di carico per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica in base al protocollo del produttore.

Applicare la sospensione cellulare sulla colonna MS ed eliminare il flusso contenente le cellule non etichettate. Aggiungere 500 microlitri del tampone di carico per lavare la colonna e rimuoverlo dal separatore. Posizionare la colonna su una provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere 1 millilitro del tampone di caricamento nella colonna. Infine, spingere lo stantuffo verso il fondo della colonna per eliminare le celle etichettate magneticamente.