Isolamento delle cellule immunitarie dai plessi coroidi di topo

Posiziona il cervello di un topo con il lato dorsale rivolto verso l'alto.

Al microscopio, separare gli emisferi cerebrali. Tirare via la corteccia e poi l'ippocampo per esporre i ventricoli laterali e il terzo ventricolo.

Raccogli due plessi coroidei laterali. Si tratta di strutture cerebrali ricche di cellule immunitarie che rivestono i ventricoli laterali come un lungo velo.

Raccogli il terzo plesso coroideo ventricolare, che è una struttura corta con una superficie granulare.

Staccare il cervelletto per esporre il quarto ventricolo.

Raccogli il plesso coroideo del quarto ventricolo, che è una lunga struttura globulare con una superficie granulare.

Mettere tutti i plessi coroidei in una provetta con soluzione fisiologica tamponata per mantenere l'integrità dei tessuti.

Aggiungere una soluzione di enzimi digestivi e incubare agitando.

L'enzima rompe la matrice extracellulare e allenta le cellule.

Aggiungere un tampone adatto per inattivare l'enzima.

Centrifuga per la sedimentazione delle cellule. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone fresco per ulteriori analisi.

Per iniziare, posizionare il cervello sezionato da un topo C57 nero 6 con il lato dorsale rivolto verso l'alto in una capsula di Petri e posizionare la capsula sotto gli obiettivi delle lenti binoculari. Mantenendo il cervello in posizione usando il forcipe, inserire le due estremità di un altro paio di pinze lungo la linea mediana tra gli emisferi.

Usando il forcipe, tirare la corteccia con il calloso e l'ippocampo lontano dal setto, esponendo il ventricolo laterale e una parte del terzo ventricolo. Identificare il plesso coroideo laterale come un lungo velo che riveste il ventricolo laterale e che si allarga ad entrambe le estremità. Quindi, utilizzando due estremità di una pinza sottile, raccogliere il plesso coroideo laterale. Fare attenzione a raccogliere la parte posteriore triangolare nascosta dalla piega posteriore dell'ippocampo.

Quindi, tirare la corteccia con il corpo calloso e l'ippocampo dell'emisfero controlaterale, lontano dal setto per esporre l'intero terzo ventricolo e il ventricolo laterale opposto. Utilizzando una pinza fine, raccogliere il terzo plesso coroideo identificato come una struttura corta con un aspetto superficiale granulare. Quindi, raccogli l'altro plesso coroideo laterale.

Quindi, inserire le due estremità della pinza tra il cervelletto e il mesencefalo e staccare il cervelletto dal ponte e dal midollo per esporre il quarto ventricolo. Quindi, identificare il quarto plesso coroideo come una lunga struttura globulare con un aspetto superficiale granulare che riveste il quarto ventricolo dall'estremità laterale destra all'estremità sinistra tra il cervelletto e il midollo. Usando una pinza fine, raccogli il quarto plesso coroideo.

Dopo aver incubato tutti i plessi coroidei raccolti con la collagenasi IV, pipettare delicatamente su e giù circa 10 volte per finalizzare la dissociazione. Quindi, riempire la provetta fino a 1,5 millilitri con tampone MACS per arrestare l'attività della collagenasi IV. Quindi, centrifugare le cellule e scartare il surnatante prima di lavare le cellule con 1,5 millilitri di tampone MACS. Dopo aver aggiunto le microsfere di compensazione e le soluzioni anticorpali appropriate, incubare i campioni su ghiaccio per 30-45 minuti, proteggendoli dall'esposizione alla luce. Quindi, riempire le provette con 1,5 millilitri di tampone MACS.