Ottenimento di una coltura di cellule gliali miste da un cervello di topo neonatale

Inizia con un cervello di topo neonatale e trasferiscilo in una provetta contenente una soluzione di enzima proteolitico.

Gli enzimi degradano la matrice extracellulare del tessuto e avviano la dissociazione cellulare.

Lavare ripetutamente il tessuto digerito con un terreno di coltura per rimuovere gli enzimi.

Utilizzare una pipetta di diametro maggiore per spostare ripetutamente il tessuto attraverso la pipetta per dissociarlo in frammenti più piccoli.

Quindi, utilizzando una pipetta di diametro inferiore, continuare a dissociare i frammenti, creando una sospensione cellulare.

Filtrare questa sospensione per rimuovere i grumi cellulari e ottenere una sospensione unicellulare contenente neuroni primari e una popolazione mista di cellule gliali, tra cui microglia e astrociti.

Seminare le cellule in un pallone di coltura contenente un terreno di coltura e incubare per favorirne l'aderenza.

Nel tempo, l'assenza di fattori di crescita neuronali nei mezzi provoca la morte neuronale.

Sostituire i supporti esauriti con supporti nuovi. Le cellule gliali utilizzano i nutrienti e proliferano, generando una coltura gliale mista di astrociti e microglia.

Trasferire il cervello in una provetta da 50 millilitri contenente 2 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Lavare il cervello con un terreno di coltura fresco, aggiungendo e rimuovendo il terreno. Dopo il completamento dei lavaggi, aggiungere 2 millilitri di terreno di crescita per cervello e omogeneizzare triturando il cervello.

Quando il tessuto cerebrale non si riduce, passare a una pipetta con un'apertura più piccola. Al termine della titolazione, quando la sospensione è limpida e priva di pezzi visibili, passare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micron per creare una coltura di una singola cellula.

Quindi, pipettare da 8 a 9 millimetri di terreno di crescita in fiasche T75, due fiasche per cervello e aggiungere 1 millilitro di cervello omogeneizzato a ciascuna fiaschetta. Far crescere le cellule fino all'isolamento il 16° giorno.