Ottenere varie popolazioni di cellule neurali da un ippocampo di ratto

Prendi frammenti di ippocampo di ratto perfusi.

Incubare con papaina per digerire la matrice extracellulare del tessuto e allentare le cellule, inclusi neuroni, astrociti e microglia.

Aggiungere la DNasi e mescolare.

Dissociare meccanicamente il tessuto utilizzando pipette di diametro progressivamente decrescente per ottenere una sospensione monocellulare. Incubare per la DNasi per degradare il DNA contaminante.

Passare la sospensione attraverso un colino, rimuovendo i detriti.

Aggiungere tampone contenente ioni bivalenti per fermare l'attività enzimatica.

Centrifugare e rimuovere il surnatante ricco di enzimi.

Ora, aggiungi tampone e perline magnetiche anti-mielina. Incubare per le perle per legare i detriti di mielina.

Dopo l'incubazione, centrifugare e rimuovere il surnatante.

Risospendere la miscela in tampone e caricarla su una colonna di separazione magnetica contenente sfere ferromagnetiche poste nel campo magnetico del selezionatore magnetico.

Il campo magnetico trattiene i detriti di mielina legati a biglie magnetiche nella colonna mentre le cellule prive di mielina passano attraverso.

Lavare la colonna con tampone e raccogliere il flusso contenente neuroni, astrociti e microglia.

Iniziare la dissociazione neurale utilizzando lame di rasoio sterili per tagliare a cubetti ogni campione raccolto dai tessuti cerebrali adulti in piccoli pezzi da 30 a 400 milligrammi sul coperchio di una piastra di coltura a sei pozzetti. Quindi immergere il tessuto in 1 millilitro di HBSS privo di calcio e magnesio e utilizzare una pipetta per trasferire i campioni in provette da centrifuga sterili da 2 millilitri.

Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, centrifugare i campioni, aspirare i surnatanti e incubare i campioni per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, capovolgendo la provetta più volte ogni cinque minuti per risospendere i pezzi di tessuto depositati.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di provetta miscelata enzimatica appena preparata a ciascun campione e capovolgere delicatamente le provette. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur etichettata 1, dissociare ogni campione con triturazione 30 su e giù, facendo attenzione a non generare bolle. Incubare i campioni per altri 15 minuti a 37 gradi Celsius con inversione ogni cinque minuti, seguita dalla dissociazione dei campioni con la pipetta Pasteur numero 2, come appena dimostrato.

Quindi, passare alla pipetta numero 3. Ripetere la dissociazione e incubare i campioni per altri 10 minuti nel bagno d'acqua, con inversione ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, filtrare le sospensioni a singola cellula attraverso filtri cellulari da 80 micron in provette Falcon da 15 millilitri, lavando ogni filtro con 10 millilitri di HBSS privo di calcio e magnesio per fermare le reazioni enzimatiche. Quando l'ultimo campione è stato filtrato, centrifugare le provette e aspirare i surnatanti.

Per esaurire la mielina dalle sospensioni cellulari, risospendere accuratamente i pellet in 400 microlitri di tampone per la rimozione della mielina e aggiungere la quantità appropriata di perle per la rimozione della mielina a ciascun tubo. Pipettare le soluzioni su e giù fino a quando le cellule e le perle non sono completamente miscelate. Quindi, incubare il campione a 4 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo l'incubazione, lavare ogni campione in 5 millilitri di tampone di rimozione della mielina.

Mentre le celle girano, posizionare una colonna per ogni campione nel campo magnetico di un selezionatore magnetico e posizionare un filtro pulito da 80 micron sopra ogni colonna. Sciacquare tre volte ogni filtro e colonna con 1 millilitro di tampone per la rimozione della mielina, raccogliendo tutto il flusso in un contenitore per rifiuti.

Dopo l'ultimo risciacquo, posizionare i tubi a fondo tondo in polistirene da 5 millilitri direttamente sotto ogni colonna per raccogliere l'eluato. Quindi, aspirare il surnatante dai campioni e risospendere i pellet in 500 microlitri di tampone di rimozione della mielina.

Applicare immediatamente le sospensioni cellulari alle colonne, raccogliendo le cellule nelle provette sottostanti. Quindi, sciacquare ogni filtro e colonna 4 volte con 1 millilitro di tampone per la rimozione della mielina per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare le cellule e aspirare i surnatanti.