Ottenere fette di cervelletto da un cervello di pulcino embrionale

Prendi un uovo di gallina fecondato in uno stadio di sviluppo adeguato.

Taglia il guscio per accedere all'embrione.

Individuare e sezionare la testa, quindi trasferirla in una capsula di Petri contenente tampone fosfato refrigerato.

Rimuovi gli occhi e le mascelle.

Separare la pelle dalla superficie del cranio.

Quindi, taglia e rimuovi le ossa del cranio.

Elimina il tessuto connettivo circostante per esporre il cervello.

Separa il proencefalo.

Quindi, staccare il cervelletto dal rombencefalo e dal vaso sanguigno.

Trasferire il cervelletto in un tampone di sale freddo.

Il cervelletto embrionale contiene uno strato di cellule progenitrici neuronali in rapida divisione, il che lo rende prezioso per gli studi di neurogenesi.

Posiziona il cervelletto sulla piattaforma di un tritafazzoletti.

Rimuovere il tampone in eccesso e affettare il cervelletto.

Mettere il tampone di sale freddo sulle fette.

Trasferire le fette di cervelletto in una capsula di Petri contenente tampone salino freddo.

Al microscopio, separare le singole fette per ulteriori analisi.

Per iniziare, metti le uova di gallina marroni fecondate in un'incubatrice a 38 gradi Celsius fino a raggiungere il giorno 14 dell'embrione. Il giorno 14 dell'embrione, taglia un'apertura nell'uovo per esporre l'embrione e decapita l'embrione di pollo in ovo. Metti la testa in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato.

Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza standard per praticare un'incisione dietro ciascun occhio, attraverso tutto il tessuto, e rimuovere gli occhi e la mascella superiore. Quindi, fai una seconda incisione fino in fondo alla faringe per rimuovere la mascella inferiore. Quindi, usa una pinza standard per rimuovere la pelle dalla superficie del cranio staccandola. Quindi, rimuovere le ossa frontali e parietali, rivelando il cervello.

Da un punto di vista ventrale, rimuovere la cartilagine faringea e il mesenchima ausiliario. Quindi, posizionare il cervello, con il lato dorsale rivolto verso l'alto e rimuovere con cura il mesenchima, dorsale al rombencefalo, facendo attenzione a non danneggiare il pia. Successivamente, fai un'incisione attraverso il tessuto tra il mesencefalo e il rombencefalo per staccare il rombencefalo, compreso il cervelletto. Praticare incisioni lungo tutto il tessuto in entrambe le giunzioni laterali del cervelletto e della placca alare del rombencefalo. Rimuovere l'intero cervelletto, avendo cura di mantenere l'integrità della pia durante tutta la dissezione.

Infine, rimuovere il plesso coroideo in formazione e spostare il cervelletto sezionato in HBSS ghiacciato. Trasferire l'intero cervelletto sulla piattaforma sterile di un tritafazzoletti, utilizzando una spatola o una pipetta Pasteur da 3 millilitri con la punta tagliata per allargare l'apertura. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pipetta.

Impostare la velocità di taglio del tritatutto al 50% del suo valore massimo. Quindi, tagliare il cervelletto nell'orientamento richiesto a uno spessore di 300 micrometri. Usando una pipetta Pasteur da 3 millilitri, coprire il cervelletto affettato con HBSS freddo.

Quindi, trasferire l'HBSS e le fette in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente 20 millilitri di HBSS ghiacciato, utilizzando la pipetta Pasteur da 3 millilitri con la punta tagliata. Posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio da dissezione, illuminata con una sorgente luminosa a fibre ottiche. Quindi, usa una pinza da orologiaio per separare le singole fette di tessuto cerebrale.