Differenziazione di progenitori otici multipotenti immortalizzati in neuroni gangliari a spirale e valutazione della differenziazione

Prelevare una piastra multipozzetto contenente vetrini coprioggetti sterili rivestiti con un substrato di coltura cellulare.

Introdurre progenitori otici multipotenti immortalizzati, o iMOPs, in un mezzo di differenziazione neuronale.

Gli iMOP sono precursori di varie cellule dell'orecchio interno, inclusi i neuroni gangliari a spirale, o SGN, che trasmettono informazioni uditive al cervello.

Incubare, lasciando che le cellule aderiscano al substrato. Il mezzo induce la differenziazione degli iMOP in SGN.

Aggiungere un fissativo per indurre la reticolazione delle proteine, preservando la morfologia cellulare, e una soluzione detergente per permeabilizzare le membrane cellulari.

Introdurre un reagente bloccante per evitare l'etichettatura non specifica.

Aggiungere anticorpi coniugati con fluorofori specifici per i marcatori di differenziazione neuronale e incubare, consentendo agli anticorpi di marcare gli SGN.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati e montare i vetrini coprioggetti con un mezzo di montaggio contenente una colorazione nucleare fluorescente.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, rileva i segnali anticorpali per confermare la differenziazione degli iMOP in SGN.

Per prima cosa, pulire i vetrini coprioggetti rotondi mettendoli in una piastra sterile da 100 millimetri e immergendoli in etanolo al 70%. Agitare delicatamente i vetrini coprioggetti per assicurarsi che siano coperti e lasciare il piatto a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte in 1x PBS sterile e poi una volta con acqua sterile.

Quindi, lasciare asciugare i vetrini coprioggetti esponendoli alla luce UV in una cappa di coltura tissutale per 15 minuti. Per un uso immediato, posizionare un vetrino coprioggetti sterile in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che tutti i vetrini coprioggetti siano piatti. Quindi, rivestire i vetrini coprioggetti aggiungendo 0,25 millilitri di 1x PBS contenente 10 microgrammi per millilitro di poli-D-lisina a ciascun pozzetto.

Dopo che la piastra è stata incubata per un'ora a 37 gradi Celsius, rimuovere la soluzione di poli-D-lisina e lavare i pozzetti tre volte con 1x PBS sterile. Una volta aspirato il liquido dell'ultimo lavaggio, introdurre 0,25 millilitri di 1x PBS contenente 10 microgrammi per millilitro di laminina in ciascuno dei 24 pozzetti. Dopo aver incubato la piastra per una notte a 37 gradi Celsius, aspirare la soluzione di laminina. Quindi, lavare ogni pozzetto con 1 millilitro di 1x PBS tre volte, ma lasciare il PBS dell'ultimo lavaggio nei pozzetti fino a quando le celle non sono pronte per essere piastrate.

Per iniziare la differenziazione neuronale, contare le cellule dalle otosfere dissociate come descritto in precedenza e poi risospenderle in un mezzo di differenziazione neuronale preriscaldato. Procedere seminando tra 1 e 1,5 x 10⁵ celle iMOP in ciascun pozzetto della piastra contenente i vetrini coprioggetti rivestiti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, sostituendo il mezzo di differenziazione neuronale a giorni alterni.

Dopo sette giorni, aspirare il terreno e fissare le cellule, che devono essere attaccate ai vetrini, aggiungendo il 4% di formaldeide in ogni pozzetto e lasciandole per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere la formaldeide e lavare le cellule una volta in 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100. Quindi, rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere a ciascun pozzetto il tampone bloccante costituito da 1x PBS contenente il 10% di siero di capra normale e lo 0,1% di Triton X-100.

Lasciare le celle per un'ora a temperatura ambiente, quindi rimuovere il liquido e sostituirlo con un tampone bloccante contenente l'appropriata diluizione dell'anticorpo Cdkn1b o Tubb3. Dopo un'incubazione notturna a 4 gradi Celsius, lavare le cellule una volta con 1x PBS contenente l'1% di Triton X-100 e quindi procedere con l'immunocolorazione come descritto in precedenza. Dopo che la colorazione è stata completata, eseguire un lavaggio finale aggiungendo 1x PBS ai pozzetti.

Per prepararli per l'analisi, rimuovere i vetrini coprioggetti a cui sono attaccate le cellule coloranti dalla piastra a 24 pozzetti e posizionarli sul terreno di montaggio su un vetrino. Dopo aver lasciato asciugare il mezzo di montaggio per una notte a 4 gradi Celsius, acquisire immagini di epifluorescenza come descritto in precedenza.