Coltura ex vivo e imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico

Prendi una topolina incinta transgenica, isola chirurgicamente l'utero contenente gli embrioni e lavalo per rimuovere il sangue residuo.

Rimuovere gli embrioni contenenti motoneuroni marcati in modo fluorescente e trasferirli sul coperchio di una piastra a più pozzetti.

Aggiungere l'agarosio fuso e raffreddare il coperchio per indurre la formazione del gel, incorporando gli embrioni.

Al microscopio a fluorescenza, allineare i nuclei oculomotori e gli occhi in linea e tagliare l'agarosio parallelamente alla linea.

Fissare un embrione su un tavolino e posizionarlo in una camera vibratomica riempita con un tampone per affettare a freddo.

Utilizzando il vibratomo, generare fette contenenti i nuclei oculomotori e gli occhi. I nuclei formano i nervi oculomotori che controllano il movimento degli occhi.

Trasferire le fette sugli inserti di coltura all'interno di una piastra a più pozzetti contenente un terreno di coltura e incubare.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, eseguire l'imaging a intervalli regolari per osservare i neuroni oculomotori marcati in fluorescenza che estendono gli assoni per raggiungere gli occhi.

Prima di iniziare la procedura, per prima cosa, confermare la gravidanza mediante ecografia il giorno embrionale 10,5 da un accoppiamento cronometrato. Raccogli gli embrioni, spruzza l'addome della topolina incinta con etanolo al 70% e usa le forbici per aprire la cavità addominale per estrarre l'utero. Lavare l'utero in una capsula di Petri di HBSS ghiacciato prima di posizionare l'organo in una seconda capsula di Petri di HBSS ghiacciato fresco.

Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e le loro sacche amniotiche individuali, posizionando ogni embrione sul lato inferiore del coperchio di una piastra a 12 pozzetti sul ghiaccio mentre vengono raccolti. Utilizzare la carta da filtro per rimuovere i liquidi che circondano ogni embrione senza toccare gli embrioni stessi e immergere gli embrioni in agarosio liquido al 4% a basso punto di fusione.

Mettere il coperchio del piatto sul ghiaccio per solidificare l'agarosio. Quando l'agarosio è indurito, capovolgere gli embrioni e coprire l'altro lato di ogni campione con altro agarosio. Quando il secondo volume di agarosio si è solidificato, utilizzare un microscopio da dissezione a fluorescenza per tagliare l'agarosio attorno a ciascun embrione in modo che ogni embrione sia orientato correttamente sullo stadio del vibratomo.

I nuclei oculomotori e le escrescenze primordiali degli assoni dovrebbero essere fluorescenti. Allinea ogni embrione in modo che il nucleo, gli assoni uscenti e l'occhio formino una linea e usa una lama di rasoio per tagliare l'agarosio parallelamente a questa linea. Quindi, riempi una camera del vibratomo con un tampone a fette ghiacciato e incolla il primo embrione allo stadio del vibratomo in modo che la lama sia parallela al nucleo oculomotore e agli occhi.

Quando la super colla è asciutta, immergere lo stadio del vibratomo in modo che l'embrione sia orientato verso l'esterno della lama e utilizzare una nuova lama del vibratone per ottenere fette da 400 a 450 micrometri. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire ogni fetta nel tampone di affettatura a freddo man mano che viene acquisita e utilizzare il microscopio a fluorescenza per selezionare la fetta contenente i nuclei oculomotori e gli occhi.

Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, trasferire la fetta su una coltura cellulare, inserirla in una piastra a 6 pozzetti contenente 1,5 millilitri di terreno di coltura per pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius. Rimuovere l'agarosio residuo dallo stadio inferiore e incollare l'embrione successivo sullo stadio, continuando a raccogliere le fette fino a quando tutti gli embrioni non sono stati sezionati e piastrati, e l'immagine delle fette ogni 30 minuti mediante contrasto di fase e microscopia a fluorescenza per un massimo di 72 ore.