Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in cellule endoteliali microvascolari cerebrali

Iniziare con una piastra multipozzetto contenente cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, o iPSC, in un terreno con un inibitore della Rho-chinasi, che promuove la sopravvivenza cellulare.

Sostituisci il terreno con un terreno essenziale contenente nutrienti e fattori di crescita.

Incubare per consentire la proliferazione e la differenziazione delle iPSC in cellule precursori.

Sostituire questo terreno con un terreno di differenziazione integrato con fattori di crescita dei fibroblasti e acido retinoico, quindi incubare.

I fattori di crescita facilitano la differenziazione delle cellule precursori in cellule endoteliali microvascolari, mentre l'acido retinoico promuove la sintesi delle proteine della giunzione stretta.

Lavare e trattare le cellule con una soluzione di enzima-EDTA per staccare le cellule, creando una sospensione a cellula singola.

Centrifugare per raccogliere le cellule e rimuovere il surnatante. Quindi, risospendere le cellule in un mezzo di differenziazione fresco.

Seminare questa sospensione cellulare in una piastra multipozzetto rivestita con collagene e proteine di adesione.

Incubare per consentire l'adesione cellulare, formando giunzioni strette tra le cellule, simili alle cellule endoteliali microvascolari cerebrali.

Per indurre la differenziazione della BMEC dalle iPSC umane, lavare la coltura di iPSC confluente con DPBS una volta prima di incubare le cellule con il volume appropriato di EDTA enzimatico per circa cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Quando è stata ottenuta una sospensione unicellulare, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un volume appropriato di terreno di cellule staminali, integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK per il conteggio.

Diluire le cellule a una concentrazione di 1,56 volte 10 per quarto di cella per centimetro cubo e seminare 2 millilitri di cellule in pozzetti individuali di fondo piatto a 6 pozzetti. Dopo 24 ore nell'incubatore per colture cellulari, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con terreno E6 e rimettere la piastra nell'incubatore per altri quattro giorni.

Per purificare i BMEC derivati da iPSC, rivestire le piastre di subcoltura con il volume appropriato di una soluzione di collagene IV e fibronectina appena preparata per pozzetto e incubare le piastre per un minimo di due ore a 37 gradi Celsius.

Il sesto giorno di differenziazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet nel volume appropriato di terreno fresco privo di siero endoteliale umano integrato con B27, fattore di crescita basico dei fibroblasti e acido retinoico. Piastra le cellule in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 24 pozzetti rivestita di collagene e fibronectina.