Isolamento e coltura di neuroni embrionali di pollo su un array multi-elettrodo

Prendi un uovo di gallina fecondato contenente un embrione in fase iniziale.

Sterilizzare il guscio e aprirlo con cura.

Rimuovere l'embrione. Sezionare e trasferire la testa su una piastra di coltura contenente un tampone. Rimuovi il bulbo oculare.

Praticare un'incisione e rimuovere gli strati cutanei, esponendo il proencefalo e il mesencefalo.

Rimuovere lo strato membranoso interno e i vasi sanguigni. Sezionare e trasferire il proencefalo su una piastra di coltura con un tampone.

Tagliare il tessuto in frammenti più piccoli e trasferirli in un tubo conico. Una volta che i frammenti si sono depositati, rimuovere il tampone.

Aggiungere una soluzione di enzima proteolitico. Incubare per digerire la matrice extracellulare del tessuto e allentare i neuroni.

Rimuovere i terreni ricchi di enzimi, lavare con terreni neurobasali, rimuovendo eventuali enzimi rimanenti.

Aggiungere terreni neurobasali. Dissociare meccanicamente il tessuto per ottenere una sospensione neuronale.

Semina questi neuroni su un sistema di array multi-elettrodo rivestito con una matrice extracellulare. Aggiungere terreni neurobasali e incubare.

I neuroni si attaccano ed estendono le proiezioni, formando una rete neuronale.

Il giorno della placcatura neuronale, rimuovere una fiala di matrice extracellulare dal congelatore a -20 gradi Celsius. Spruzzare con etanolo al 70% e mettere sul ghiaccio. Assicurati di scongelare la matrice extracellulare sul ghiaccio. Non scongelare a temperatura ambiente, poiché l'ECM polimerizza a una temperatura superiore a 0 gradi Celsius.

Lavorare nella cappa BSL-2 per diluire la matrice extracellulare al 25% aggiungendo 300 microlitri di terreno neurobasale freddo all'aliquota da 100 microlitri. Quindi, utilizzare una pipetta P200 per aggiungere 100 microlitri di soluzione di matrice extracellulare al 25% al centro dell'array multielettrodo, facendo attenzione a non toccare gli elettrodi. Rimuovere immediatamente l'ECM, lasciando una pellicola sottile sulla superficie.

Coprire l'array multielettrodo e posizionarlo nell'incubatore di coltura tissutale fino al momento di placcare i neuroni. Inizia l'isolamento dei neuroni di pollo sterilizzando il guscio esterno di un uovo E7 con etanolo al 70%. È importante mantenere condizioni sterili da questo punto in poi. Assicurarsi che tutti gli strumenti siano sterilizzati con etanolo al 70% e che le soluzioni siano sterili. È utile utilizzare una cappa di dissezione, ma non è assolutamente necessaria per le dissezioni, se viene eseguita rapidamente.

Quindi, dopo aver recuperato e decapitato l'embrione, tagliare intorno agli occhi e rimuovere i bulbi oculari. Successivamente, utilizzare la pinza fine Dumont numero 5 e le forbici a molla per praticare un'incisione sul lato ventrale e rimuovere gli strati esterni della pelle per esporre il proencefalo e il tectum ottico. Sbucciare e rimuovere con cura la membrana della buccia.

Trasferisci il proencefalo in un'altra capsula di Petri contenente HBS e taglialo a pezzetti di circa 2 millimetri con le forbici a molla. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire i pezzi di proencefalo in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Dopo che i pezzi di proencefalo sono affondati sul fondo della provetta da centrifuga, rimuovere quanto più HBS possibile.

Quindi, aggiungere 1 millilitro di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,5% e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Usa una pipetta Pasteur per rimuovere con cura la tripsina senza disturbare i pezzi di tessuto. Aggiungere 1 millilitro di terreno neurobasale e lasciare che i pezzi di tessuto affondino sul fondo. Dopo aver rimosso il terreno e ripetuto il lavaggio, aggiungere 2 millilitri di terreno neurobasale e triturare delicatamente fino a quando non si vedono più pezzi di tessuto.

Diluire le cellule risospese da 1 a 10 con terreno neurobasale e contare le cellule vitali utilizzando il colorante blu di tripano e un emocitometro. Dopo il conteggio, piastrate le celle associate su array di multielettrodi rivestiti con ECM a una densità di 2.200 celle per millimetro quadrato.