Generazione di un chip barriera emato-encefalica utilizzando cellule precursori derivate da iPSC

Prendiamo un chip microfluidico con canali sovrapposti, rivestiti di matrice, separati da una membrana porosa.

Semina le cellule progenitrici neurali derivate da iPSC nel canale superiore. Incubare per l'aderenza cellulare, quindi lavare per rimuovere le cellule non attaccate.

Successivamente, seminare cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC nel canale inferiore.

Capovolgere il chip e incubarlo per collegare le cellule endoteliali al lato della membrana del canale inferiore.

Quindi, capovolgi il chip per attaccare le celle al lato inferiore del canale, formando una struttura tubolare monostrato. Lavare entrambi i canali con terreni specifici per cellule.

Fluiscono continuamente un mezzo di differenziazione neurale nel canale superiore e un mezzo cellulare endoteliale nel canale inferiore.

Le cellule endoteliali utilizzano fattori di crescita dal mezzo alla maturità e formano giunzioni strette simili a un vaso sanguigno, formando il lato del sangue.

I fattori neurotrofici guidano la differenziazione delle cellule progenitrici neurali in varie cellule cerebrali, formando il lato cerebrale. Queste cellule interagiscono con le cellule endoteliali, creando una barriera emato-encefalica sul chip.

Per iniziare, porta il piatto contenente le patatine preparate nell'armadio di biosicurezza. Utilizzando una pipetta P200, lavare delicatamente entrambi i canali aggiungendo 200 microlitri di terreno di differenziazione neurale nell'ingresso ed estraendo il liquido dall'uscita. Evitando il contatto con le porte, aspirare con cura le goccioline di fluido in eccesso dalla superficie del chip.

Agitare delicatamente la sospensione cellulare per garantire una sospensione cellulare omogenea. Per seminare le cellule progenitrici neurali derivate da iPSC nel canale superiore per generare il lato cerebrale, aggiungere un puntale P200 contenente da 30 a 100 microlitri di sospensione cellulare alla concentrazione di 1 x 10⁶ cellule per millilitro all'ingresso del canale superiore e rilasciare delicatamente il puntale dalla pipetta.

Prendere una pipetta P200 vuota per premere lo stantuffo, inserirla nell'uscita del canale superiore e tirare con cautela la sospensione a cella singola attraverso il puntale. Trasferire il chip al microscopio per verificare la densità di semina nella distribuzione omogenea delle cellule all'interno del canale superiore. Dopo aver confermato la densità cellulare al 20% di copertura, posizionare immediatamente i chip nell'incubatore per due ore a 37 gradi Celsius.

Successivamente, lavare via le cellule che non si attaccano aggiungendo un nuovo mezzo di differenziazione neurale nell'ingresso e raccogliendo il liquido con una pipetta dall'uscita. Mantenere le cellule in condizioni statiche a 37 gradi Celsius con una sostituzione giornaliera del mezzo di differenziazione neurale. Dopo che le iNPC si sono attaccate o il giorno successivo alla semina, portare la capsula contenente le patatine preparate nella cappa di biosicurezza. Lavare delicatamente il canale inferiore con 200 microlitri di terreno cellulare endoteliale.

Evitando il contatto con le porte, aspirare con cura le goccioline di terreno cellulare endoteliale in eccesso dalla superficie del chip, assicurandosi di lasciare il terreno in entrambi i canali. Agitare delicatamente la sospensione cellulare per garantire una sospensione cellulare omogenea. Utilizzando una pipetta P200, aspirare da 30 a 100 microlitri di sospensione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC alla concentrazione di 14-20 x 10⁶ cellule per millilitro e posizionare la punta nell'ingresso del canale inferiore.

Il passaggio più critico per ottenere le proprietà di barriera funzionale è la semina delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali. È fondamentale seminare le cellule alla giusta densità per evitare la formazione di bolle per verificare una distribuzione omogenea all'interno della guaina dell'organo.

Premere lo stantuffo di una pipetta P200 con il puntale vuoto, inserirlo nell'uscita del canale inferiore e rilasciare lentamente lo stantuffo della pipetta per tirare con cautela la sospensione a cella singola attraverso il canale inferiore. Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla superficie del chip. Evitare il contatto diretto con le porte di ingresso e uscita per garantire che nessuna sospensione di celle venga aspirata fuori dai canali. Trasferire il chip al microscopio per controllare la densità di semina.

Il canale inferiore è riempito di celle senza spazi osservabili in mezzo. Dopo aver confermato la corretta densità cellulare, semina le celle nei trucioli rimanenti. Per attaccare le cellule alla membrana porosa, che si trova sopra il canale inferiore, capovolgere ogni chip e lasciarle riposare in una base per chip. Posizionare un piccolo serbatoio contenente DPBS sterile all'interno del piatto da 150 millimetri per fornire umidità alle cellule.

Incubare i chip a 37 gradi Celsius per circa tre ore o fino a quando le cellule nel canale inferiore non si sono attaccate. Una volta che le cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC si sono attaccate, capovolgere i chip in posizione verticale per consentire l'attacco delle cellule alla parte inferiore del canale inferiore. 48 ore dopo l'inseminazione delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC, equilibrare la temperatura del mezzo cellulare endoteliale riscaldandola in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi, degassare il terreno mediante incubazione sotto un sistema di filtrazione a vuoto per 15 minuti. Quindi, disinfettare l'esterno dell'imballaggio del modulo portatile e dei vassoi con etanolo al 70%, pulirli e trasferirli nell'armadio di biosicurezza. Aprire la confezione e posizionare i moduli nel vassoio. Orientali con i serbatoi verso il retro del vassoio. Pipettare 3 millilitri di fluido caldo pre-bilanciato in ciascun serbatoio di ingresso. Aggiungere il terreno di coltura cellulare endoteliale al serbatoio di ingresso del canale inferiore e il terreno di differenziazione neurale al serbatoio di ingresso del canale superiore del canale superiore.

Quindi, pipettare 300 microlitri di fluido caldo pre-bilanciato in ciascun serbatoio di uscita direttamente su ciascuna porta di uscita. Posiziona fino a 6 moduli portatili su ciascun vassoio. Portare i vassoi nell'incubatore e farli scorrere completamente nel modulo di coltura con la maniglia del vassoio rivolta verso l'esterno. Selezionare ed eseguire il ciclo principale sul modulo di coltura. Chiudere lo sportello dell'incubatore e lasciare che il modulo di coltura adeschi i moduli portatili per circa un minuto.

Il ciclo di adescamento è completato quando sulla barra di stato viene visualizzato il messaggio "Pronto". Rimuovere il vassoio dal modulo di coltura e portarlo nella cappa di biosicurezza. Ispezionare la parte inferiore di ciascun modulo portatile nella cabina di biosicurezza per verificare che i moduli portatili siano stati adescati correttamente. Cerca la presenza di piccole goccioline su tutte e quattro le porte. Se un modulo portatile non mostra goccioline, eseguire nuovamente il ciclo di prima pagina su tali moduli. Se un materiale gocciola sul vassoio, cosa che accade più spesso dalle porte di uscita, pulire il vassoio con etanolo al 70%.

Quindi, lavare delicatamente entrambi i canali di ciascun chip con un terreno di coltura caldo ed equilibrato specifico per le cellule per rimuovere eventuali bolle nel canale e posizionare piccole goccioline di terreno sulla parte superiore di ciascuna porta di ingresso e uscita. Inserisci i chip con i supporti nei moduli portatili e posizionane fino a sei su ciascun vassoio. Inserire i vassoi nel modulo di coltura. Programmare le condizioni di coltura del chip dell'organo appropriate, come la velocità di flusso e l'allungamento sul modulo di coltura. Non appena il ciclo di Regolazione è completato, che dura circa due ore, iniziano le condizioni programmate. Successivamente, il modulo di coltura inizia a fluire alle condizioni di coltura preimpostate per il chip dell'organo.