Isolamento e coltura di cellule da telencefali dorsolaterali embrionali di topo

0 visualizzazioni4:47 min • July 8th, 2025

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Prendi un embrione di topo in un tampone e separa il cranio per isolare il cervello.

Rimuovere le meningi, lo strato membranoso che copre il cervello.

Sezionare il cervello per separare gli emisferi.

Isolare i telencefali dorsolaterali dagli emisferi e trasferirli in un tubo.

I telencefali dorsolaterali sono ricchi di neuroni e cellule progenitrici neurali.

Centrifugare e rimuovere il surnatante.

Aggiungere una soluzione enzimatica. Gli enzimi scompongono la matrice tissutale, allentando le cellule.

Introdurre un mezzo di proliferazione contenente siero. Le proteine del siero inibiscono l'attività enzimatica.

Utilizzare una pipetta per dissociare meccanicamente il tessuto, formando una sospensione cellulare.

Centrifugare e rimuovere il surnatante contenente enzimi inattivati e detriti tissutali.

Risospendere le cellule nel mezzo di proliferazione.

Trasferire le cellule su una micropiastra rivestita di substrato di coltura cellulare.

Incubare per far aderire le cellule al substrato. Il terreno facilita la proliferazione delle cellule progenitrici.

Iniziare rimuovendo i cervelli da 5 a 10 embrioni E14 in una capsula di Petri con mezzo di dissezione freddo. Usa il forcipe per estrarre con cura la pelle e il cranio e isolare il cervello. Mentre si lavora sotto lo stereomicroscopio, utilizzare una pinza di dissezione per rimuovere le meningi. Quindi, dividi il telencefalo al centro per separare gli emisferi.

Per isolare il telencefalo dorsolaterale tagliare lungo la curva dorsomediale e il confine palliale-subpalliale. Trasferire il telencefalo dorsolaterale in un tubo da 2 millilitri con mezzo di dissezione su ghiaccio fino a quando tutti i cervelli non sono stati sezionati. Dopo la microdissezione del telencefalo dorsolaterale, posizionare il tessuto in un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi, centrifugare la provetta contenente il tessuto raccolto e il mezzo di dissezione a freddo per 5 minuti a 4 gradi Celsius e 340 volte g per far precipitare il tessuto. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante con la pipetta e aggiungere 1 millilitro di 37 gradi Celsius 0,05% tripsina-EDTA per la digestione chimica. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, aggiungere 2 millilitri di terreno di proliferazione per inibire l'attività della tripsina. Quindi, lucidare la punta di una pipetta di vetro Pasteur su un bruciatore a gas o un bruciatore Bunsen per alcuni secondi per restringere leggermente l'apertura. Aspirare FCS per rivestire la punta della pipetta. Quindi, dissociare meccanicamente le cellule con la pipetta Pasteur lucidata a fuoco e rivestita con FCS pipettando su e giù facendo attenzione a non generare bolle.

Centrifugare le cellule dissociate per 5 minuti a 4 gradi Celsius e 340 volte g. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Quindi, aggiungere 1 millilitro di terreno di proliferazione e risospendere le cellule utilizzando una pipetta. Rimuovere il PBS dalla piastra pretrattata con poli-D-lisina. Quindi, disegna un segno sul fondo della piastra che può essere utilizzato come riferimento per determinare il punto zero.

Dopo aver risospeso le cellule nel mezzo di proliferazione per la seconda volta, preparare una diluizione 1 a 1 della sospensione cellulare utilizzando una soluzione di blu di tripano allo 0,4%. Caricare i vetrini della camera di conteggio e contare il numero di cellule vitali non colorate. Le celle non vitali saranno blu. Diluire le cellule nel mezzo di proliferazione per ottenere10-6 cellule per millilitro. Aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

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Ultimo aggiornamento: 15 agosto 2026