Stabilire una coltura cellulare primaria di gangli della radice dorsale da una colonna vertebrale di ratto

Prendi una colonna vertebrale di ratto. Fai due tagli lungo i lati e un taglio laterale.

Rimuovere i muscoli dorsali e la porzione dorsale delle vertebre.

Estrarre il midollo spinale.

Identificare i gangli della radice dorsale, o DRG, situati bilateralmente lungo le vertebre lombari.

I DRG contengono neuroni circondati da cellule gliali.

Esci i DRG e raccoglili in un piatto. Lavare ripetutamente il fazzoletto con un terreno privo di siero.

Trasferire i DRG in una piastra contenente una soluzione di collagenasi e incubare. La collagenasi degrada la matrice extracellulare.

Lavare con tampone. Aggiungere tripsina-EDTA e incubare per interrompere le giunzioni cellula-cellula, allentando le cellule.

Trasferire i DRG in una provetta, centrifugare ed eliminare il surnatante.

Risospendere il tessuto nel terreno di coltura e pipettare ripetutamente per rilasciare le cellule.

Trasferire le cellule su una piastra di coltura rivestita di polimero per facilitarne l'attaccamento.

Rimuovere il terreno e aggiungere nuovi terreni contenenti inibitori e fattori di crescita.

Gli inibitori limitano la proliferazione delle cellule gliali, mentre i fattori di crescita promuovono la crescita neuronale.

Raccogli i gangli della radice dorsale lombare dal tronco di un ratto di due o tre settimane. Inizia praticando due tagli lungo i lati della colonna vertebrale e un taglio laterale per segnare l'estensione rostrale della colonna lombare. Quindi, usa una pinza per tagliare le ossa per rimuovere i muscoli dorsali della colonna vertebrale. Quindi, rimuovere la parte dorsale delle vertebre ed esporre il midollo spinale, quindi utilizzare le forbici da dissezione e le pinze per rimuovere il midollo spinale.

Identificare il DRG lombare contando le vertebre dall'ultima costola. Questo diagramma mostra le posizioni delle vertebre. Usa le micro-forbici per raccogliere i 12 DRG lombari bilaterali da L1 a L6. Rimuovere tutte le fibre neuronali attaccate per migliorare la purezza della coltura. Trasferire ogni DRG lombare in una piastra di coltura da 35 millimetri contenente 2 millilitri di terreno ghiacciato privo di siero.

Trasferire la piastra da 35 millimetri contenente DRG in una cappa laminare e lavare il DRG con terreno privo di siero tre volte con una pipetta. Utilizzare pinzette sterili per spostare i DRG in un nuovo piatto di coltura da 35 millimetri contenente 2 millilitri di collagenasi sterile di tipo 1A. Posizionare il tessuto in soluzione di collagenasi nell'incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius per 30 minuti per iniziare la dissociazione delle cellule.

Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di collagenasi e lavare il DRG tre volte in 2 millilitri della soluzione salina bilanciata di Hank. Successivamente, aggiungere 2 millilitri di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,05% al piatto e digerire il DRG nell'incubatore per 30 minuti come prima. Dopo la digestione, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire i 2 millilitri di soluzione contenente DRG in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Il DRG potrebbe attaccarsi alla pipetta di vetro, quindi questo passaggio deve essere eseguito con cura. La perdita di DRG può essere evitata mantenendo la soluzione contenente DRG nell'estremità conica della pipetta di vetro e trasferendo la soluzione nella provetta da centrifuga lentamente ma senza pause.

Quindi, centrifugare la soluzione a 290 volte g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere altri 2 millilitri di terreno privo di siero per risospendere il DRG. Ripetere il lavaggio due volte utilizzando 2 millilitri di terreno di coltura preriscaldato per risospendere il tessuto dopo la centrifugazione finale.

Utilizzare la pipetta sterile lucidata a fiamma precedentemente preparata per triturare manualmente il DRG circa 60 volte. Quindi, rimuovere dall'incubatore a CO2 una piastra a 24 pozzetti rivestita di poli-L-lisina contenente 1 millilitro di terreno di coltura per pozzetto. Aspirare il terreno di coltura incubato dal piatto.

Semina le cellule DRG da un ratto in quattro dei pozzetti. Ciò fornisce una densità di semina di circa 500.000 cellule per pozzetto. Il giorno seguente, sostituire il terreno di coltura con un terreno integrato con 10 micromolari di AraC e 100 nanogrammi per millilitro di NGF.