Infezione dei neuroni primari del mesencefalo di topo con virus adeno-associati ingegnerizzati

Inizia con una coltura embrionale di cellule del mesencefalo di topo su un vetrino coprioggetti.

Trattare con virus adeno-associati ingegnerizzati che codificano un complesso indicatore di calcio fluorescente sotto un promotore neurone-specifico.

Incubare per l'attaccamento virale e l'internalizzazione.

Rimuovere il terreno per eliminare i virus non legati, quindi aggiungere un terreno di coltura e incubare.

I virus internalizzati rilasciano il loro genoma nel nucleo, dove il promotore neurone-specifico guida la produzione di complessi indicatori di calcio esclusivamente nei neuroni primari.

Questi complessi includono una proteina fluorescente marcata con una proteina legante il calcio e un peptide M13.

Trasferire il vetrino coprioggetti in un piatto con un tampone di registrazione ricco di ioni calcio, quindi posizionarlo in una camera di registrazione per l'imaging confocale dal vivo.

Introdurre un tampone di registrazione del glutammato, che provoca il legame del glutammato con i canali ionici, portando all'ingresso di ioni calcio.

Questi ioni si legano al complesso, provocando un cambiamento conformazionale e l'emissione di fluorescenza.

Nell'imaging dal vivo, i neuroni luminosi indicano l'infezione virale.

Inizia preparando 1 millilitro di terreno DMEM senza siero con 1 microlitro di hSyn-GCaMP6f AAV per piatto. Aspirare il terreno di coltura cellulare da ogni piatto e sostituirlo con 1 millilitro di DMEM preparato con hSyn-GCaMP6f. Rimetti i piatti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, aspirare il terreno con AAV e sostituirlo con 3 millilitri di terreno di coltura cellulare. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per cinque-sette giorni, cambiando il terreno ogni due o tre giorni durante questo periodo di infezione virale.

Preparare 1 litro di tampone di registrazione HEPES, 200 millilitri di tampone di registrazione del glutammato 20 micromolari e 200 millilitri di tampone di registrazione NBQX da 10 micromolari, secondo le indicazioni del manoscritto.

Riempire una piastra di Petri sterile da 35 millimetri con 3 millilitri di tampone di registrazione. Prendi la capsula di Petri con le colture infette dall'incubatrice. Quindi, afferrare con cautela il bordo di un vetrino coprioggetti con una pinza a punta fine e trasferirlo nel piatto con il buffer di registrazione.

Riposizionare il vetrino rimanente nel terreno nell'incubatore a 37 gradi Celsius e trasportare la piastra con il tampone di registrazione al microscopio confocale. Avviare il software di imaging. Durante l'inizializzazione, avviare la pompa peristaltica e posizionare la linea nel buffer di registrazione. Quindi, calibrare il flusso a 2 millilitri al minuto.

Trasferire il vetrino coprioggetti infetto dalla capsula di Petri al bagno di registrazione con una pinza fine. Utilizzando l'obiettivo a immersione in acqua 10x e la luce a campo chiaro, trova il piano di messa a fuoco e cerca una regione con un'alta densità di corpi cellulari neuronali. Quindi, passa all'obiettivo 40x e rifocalizza il campione.

Seleziona e applica AlexaFluor 488 nella finestra dell'elenco dei coloranti. Per evitare la sovraesposizione e il fotosbiancamento dei fluorofori, iniziare con impostazioni di bassa HV e potenza del laser.

Per il canale AlexaFluor 488, impostare l'HV su 500, il guadagno su 1x e l'offset su 0. Impostare la potenza al 5% per la linea laser 488. Aumenta la dimensione del foro stenopeico a 300 micrometri e utilizza l'opzione di scansione "focus x2" per regolare in modo ottimale i segnali di emissione a livelli di subsaturazione. Le impostazioni possono quindi essere regolate per una visibilità ottimale di ciascun canale.

Una volta ottimizzate le impostazioni del microscopio, spostare il tavolino per individuare una regione con più cellule che mostrano cambiamenti spontanei nella fluorescenza GCaMP6f e concentrarsi sul piano desiderato per l'imaging.

Utilizzare lo strumento "Ritaglia retto" per ritagliare il fotogramma dell'immagine a una dimensione che possa raggiungere un intervallo di fotogrammi di poco inferiore a un secondo. Impostare l'intervallo su un valore di 1,0 e l'intervallo num su 600.

Per catturare un film della serie t, seleziona l'opzione "Tempo". Quindi, utilizzare l'opzione di scansione "XYt" per avviare l'imaging. Osservare la barra di avanzamento dell'imaging e spostare la linea dal tampone di registrazione HEPES al tampone di registrazione del glutammato da 20 micromolari al momento appropriato.

Al termine dell'imaging, selezionare il pulsante "serie completa" e salvare il filmato della serie t finito. Continuare a perfondere il glutammato per altri 5 minuti in modo che i neuroni coltivati siano stati esposti al glutammato per un totale di 10 minuti. Ripetere questa procedura per ogni vetrino coprioggetti da riprodurre.