Infezione dei neuroni primari del mesencefalo di topo con virus adeno-associati ingegnerizzati

Inizia con una coltura embrionale di cellule del mesencefalo di topo su un vetrino coprioggetti.

Trattare con virus adeno-associati ingegnerizzati che codificano un complesso indicatore di calcio fluorescente sotto un promotore neurone-specifico.

Incubare per l'attaccamento virale e l'internalizzazione.

Rimuovere il terreno per eliminare i virus non legati, quindi aggiungere un terreno di coltura e incubare.

I virus internalizzati rilasciano il loro genoma nel nucleo, dove il promotore neurone-specifico guida la produzione di complessi indicatori di calcio esclusivamente nei neuroni primari.

Questi complessi includono una proteina fluorescente marcata con una proteina legante il calcio e un peptide M13.

Trasferire il vetrino coprioggetti in un piatto con un tampone di registrazione ricco di ioni calcio, quindi posizionarlo in una camera di registrazione per l'imaging confocale dal vivo.

Introdurre un tampone di registrazione del glutammato, che provoca il legame del glutammato con i canali ionici, portando all'ingresso di ioni calcio.

Questi ioni si legano al complesso, provocando un cambiamento conformazionale e l'emissione di fluorescenza.

Nell'imaging dal vivo, i neuroni luminos