JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:37 min. • July 8th, 2025
Prendi un ganglio della radice dorsale o DRG, un gruppo di neuroni sensoriali, in un mezzo freddo contenente siero per proteggere i neuroni durante la successiva elaborazione.
Centrifugare, quindi rimuovere il surnatante.
Aggiungere un tampone fosfato contenente enzimi digestivi e incubare con una leggera agitazione.
Gli enzimi dissociano la matrice extracellulare, o ECM, e il tessuto DRG, allentando le cellule.
Aggiungere un terreno contenente siero per inattivare gli enzimi.
Centrifugare, quindi scartare il surnatante.
Risospendere il DRG e dissociare meccanicamente il tessuto utilizzando pipette di dimensioni progressivamente più piccole per ottenere una sospensione cellulare.
Sovrapporre le cellule su un gradiente di densità di albumina sierica bovina.
centrifuga. I neuroni si depositano sul fondo, formando una pallina.
Scartare gli strati contenenti detriti di tessuto.
Risospendere i neuroni in un terreno di coltura.
Aggiungere i neuroni a un piatto di coltura rivestito di ECM e incubare.
Rimuovi il terreno e aggiungi cellule natural killer o NK.
Aggiungi un terreno alla co-coltura e studia l'interazione tra queste cellule.
Raccogli i DRG in un tubo conico da 15 millilitri riempito con 10 millilitri di DMEM integrato a freddo. Quindi, centrifugare il preparato per 5 minuti a 200 g a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Aggiungere 250 microlitri di PBS contenenti 1 milligrammo per millilitro di collagenasi IV e 2,4 unità per millilitro di Dispasi. Incubare questo DRG con una soluzione di collagenasi dispasi per 80 minuti con una leggera agitazione.
Per inattivare gli enzimi, aggiungere 5 millilitri di terreno DMEM integrato e centrifugare la soluzione a 200 g. Dopo 5 minuti, rimuovere delicatamente il surnatante utilizzando una pipetta e lasciare circa 100 microlitri di surnatante per evitare perdite cellulari indesiderate. Successivamente, aggiungere 1 millilitro di DMEM integrato nelle cellule e utilizzare una pistola per pipette e tre pipette Pasteur in vetro di dimensioni decrescenti per triturare delicatamente il DRG in una preparazione a singola cellula.
Utilizzando una pipetta P200, aggiungere la sospensione di gangli triturati contenente i neuroni sul lato della provetta nel gradiente BSA. Quindi, impostare l'accelerazione e la decelerazione al minimo per centrifugare il neurone contenente il gradiente BSA per 12 minuti a 200 g. Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere le cellule in 500 microlitri di neurobasal.
Piastra 10.000 neuroni per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti rivestita di laminina. Per consentire l'attacco dei neuroni, incubare la piastra a 96 pozzetti durante la notte a 37 gradi Celsius. Per iniziare la co-coltura, rimuovere lentamente il neurobasale dalla coltura neuronale e aggiungere 10-5 cellule NK per pozzetto alla coltura neuronale.