JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:52 min. • July 8th, 2025
Iniziare con un pozzetto contenente cellule progenitrici neurali o aggregati NPC nel terreno-1 o DM-1 differenziante.
Queste NPC sono precursori del lignaggio neurale generato da cellule staminali pluripotenti indotte umane o hiPSC utilizzando DM-1 in condizioni controllate.
Trasferire gli aggregati NPC su un inserto a membrana posto all'interno di un pozzetto contenente DM-1 e rimuovere il terreno in eccesso.
Cambiare il terreno in DM-2 e incubare.
DM-2 fornisce nutrienti e fattori di differenziazione che promuovono la maturazione delle NPC in diversi tipi di cellule neurali.
Gli NPC indifferenziati si trasformano in corpi embrioidi, noti come corpi embrioidi privi di siero o SFEB, poiché il terreno manca di siero. Questi EB assomigliano alla morfologia di un cervello in via di sviluppo.
Trasferire l'inserto in un pozzetto contenente DM-3.
DM-3 contiene fattori di crescita essenziali per il mantenimento e la crescita degli SFEB.
Incubare fino a quando gli SFEB raggiungono la dimensione desiderata.
Dopo due settimane di coltura delle cellule, preparare piastre a sei pozzetti con inserti per colture cellulari da 40 micron e 1 millilitro di terreno DM1. Incubare queste piastre per almeno quattro ore prima di aggiungere le cellule in coltura.
Successivamente, utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga da 200 microlitri, raccogliere aggregati cellulari di due settimane con circa 20 microlitri di terreno. Trasferire da quattro a sei aggregati su ciascun inserto con una soluzione minima. Rimuovere l'eccesso.
Durante questa fase, è importante lavorare velocemente e con mano ferma. Durante la rimozione del fluido intorno agli SFEB, è possibile che gli SFEB si muovano attraverso la soluzione a causa della tensione superficiale. Va bene riposizionarli dopo aver rimosso il supporto.
Una volta che tutti gli aggregati sono stati caricati sugli inserti, cambiare il terreno con 1 millilitro di DM2 e continuare a coltivare le cellule. A giorni alterni sostituire 3/4 del terreno con un terreno fresco. Dopo 14 giorni di coltura, iniziare ad aggiungere DM3 medium alle colture. Continuare la coltura per altri 16 giorni per far crescere gli SFEB.