Generazione di un modello 3D di co-coltura di fibroblasti e neuroni corneali umani

Prendiamo i fibroblasti corneali umani.

Trasferirli in un inserto a membrana all'interno di una piastra a più pozzetti contenente il terreno.

Aggiungere il terreno all'inserto della membrana. Incubare per l'aderenza dei fibroblasti all'inserto.

Quindi, sostituire il terreno con un terreno contenente vitamina C nell'inserto della membrana e nel serbatoio.

incubare. La vitamina C stimola i fibroblasti a secernere e assemblare una matrice extracellulare 3D.

Aggiungere una sospensione di cellule di neuroblastoma umano sui fibroblasti.

Incubare, consentendo l'adesione delle cellule del neuroblastoma.

Ora, aggiungi terreni contenenti acido retinoico sulle cellule e integra il serbatoio con terreni freschi.

incubare. L'acido retinoico innesca la differenziazione delle cellule del neuroblastoma in cellule progenitrici neurali.

Quindi, rimuovi il supporto. Introdurre nuovi terreni nel serbatoio. Aggiungere terreni contenenti un fattore neurotrofico all'inserto della membrana e incubare.

I fattori neurotrofici innescano la differenziazione delle cellule progenitrici nei neuroni, generando un modello di co-coltura 3D di fibroblasti e neuroni corneali umani.

Per assemblare costrutti 3D, in primo luogo, passaggio e conteggio dei fibroblasti corneali umani. Quindi, seminare circa 1 volte 10 per i 6 HCF su un inserto a membrana in policarbonato con pori da 0,4 micron. Aggiungi 1,5 millilitri di terreno fresco sulla parte superiore del costrutto. Quindi, pipettare altri 1,5 millilitri dello stesso terreno sul fondo di ciascun costrutto.

Dopo 24 ore, aggiungere 1,5 millilitri di terreno integrato con 0,5 millimolari di vitamina C nella parte superiore e inferiore di ciascun costrutto. Incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per tre settimane, aggiungendo terreno fresco contenente vitamina C a giorni alterni. Questo stimolerà le cellule a secernere e assemblare la propria matrice extracellulare. Dopo tre settimane, aggiungere 8 volte 10 alle 3 cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y sulla parte superiore dei costrutti 3D precedentemente assemblati.

In questa fase è fondamentale calcolare il numero esatto di cellule e attendere 24 ore prima di iniziare la differenziazione cellulare.

Dopo 24 ore di incubazione, avviare la differenziazione cellulare SH-SY5Y stimolando le cellule con 1,5 millilitri di EMEM con il 10% di FBS e 10 micromolari di acido retinoico. Quindi, aggiungere 1,5 millilitri del terreno contenente vitamina C sul fondo del costrutto. L'acido retinoico è sensibile alla luce, quindi questo passaggio dovrebbe essere eseguito al buio.

Dopo cinque giorni, quando le cellule hanno raggiunto la fase di differenziazione, aggiungere 1,5 millilitri di terreno privo di siero contenente 2 BDNF nanomolari e l'1% di antibiotico-antimicotico alla parte superiore del costrutto. Aggiungere un terreno fresco integrato con vitamina C sul fondo del costrutto. Coltivare le cellule per altri due giorni prima di elaborarle per ulteriori analisi.