Definizione di una configurazione a cella intera tramite il metodo Patch Clamp

0 views • 3:12 min • July 8th, 2025

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Inizia con una fetta di cervello di topo immobilizzata posizionata in una camera di registrazione della configurazione elettrofisiologica riempita con un liquido cerebrospinale artificiale per mantenere la vitalità neuronale.

La configurazione contiene una micropipetta di registrazione preassemblata riempita di soluzione cationica collegata a un amplificatore e a un'unità di controllo della pressione.

Al microscopio, individuare un neurone e posizionare la micropipetta vicino ad esso.

Applicare una pressione positiva dell'aria per rimuovere eventuali detriti.

Spostare la micropipetta verso il neurone fino a formare una fossetta sulla membrana, che indica la vicinanza neuronale.

Applicare un'aspirazione debole per estrarre un piccolo cerotto a membrana all'interno della micropipetta.

Questo crea una tenuta ermetica che aumenta la resistenza della micropipetta, confermando una tenuta stabile.

Mantenere il potenziale della cellula a un potenziale di riposo fisiologico per la stabilità cellulare.

Quindi, applicare un'aspirazione breve e forte per interrompere la membrana del cerotto, stabilendo una connessione diretta con l'interno della cellula.

Questa configurazione dell'intera cellula è pronta per registrare l'attività elettrica neuronale.

Utilizzando la rotella di messa a fuoco fine del microscopio, iniziare a mettere a fuoco verso il basso mentre si abbassa gradualmente la micropipetta. Mettere sempre a fuoco prima verso il basso, quindi abbassare la micropipetta sul piano di messa a fuoco per assicurarsi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta. Quando la micropipetta viene a contatto con la superficie della fetta, rallentare la velocità del micromanipolatore in modalità medio-bassa. Applicare delicatamente una leggera pressione positiva per rimuovere eventuali detriti sul percorso.

Quindi, avvicinati alla cella, alternando con le manopole di controllo X, Y, Z o avvicinandoti diagonalmente dove entrambi gli assi XZ vengono modificati con la rotazione della manopola dell'asse Z. Quando la micropipetta è abbastanza vicina alla cellula, sulla superficie cellulare apparirà una fossetta.

A questo punto, applicare un'aspirazione debole e breve attraverso il tubo collegato al tubo di aspirazione del portapipetta per creare una tenuta. Durante la formazione di un gigaseal, utilizzare il comandante dell'amplificatore controllato da computer per portare il potenziale di ritenzione delle cellule al potenziale di riposo fisiologico, al fine di prevenire cambiamenti improvvisi una volta che la membrana si è rotta. Dopo che il gigaseal si è formato, compensare la capacità veloce o lenta.

Qui è molto importante che l'aspirazione applicata non sia troppo forte, altrimenti la membrana potrebbe rompersi prima di stabilire la tenuta.

Se la tenuta rimane stabile e superiore a 1 giga ohm, applicare un'aspirazione breve e forte per rompere la membrana plasmatica.

L'aspirazione deve essere breve e deve essere più forte della pressione applicata quando si stabilisce una tenuta per rompere correttamente la membrana e ottenere una configurazione stabile dell'intera cella.

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Last updated: 18 July 2026