JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:57 min • July 8th, 2025
Prendiamo le cellule gangliari retiniche del pesce zebra coltivate su vetrini protettivi rivestiti.
Queste cellule esprimono un biosensore geneticamente codificato che produce la proteina fluorescente verde roGFP2 sensibile alla redox fusa con un enzima sensibile al perossido di idrogeno, Orp1.
Trasferire il vetrino coprioggetti con il terreno in una camera di imaging di cellule vive e posizionare la camera su un microscopio invertito.
Sostituire il terreno con un terreno privo di siero per ridurre la fluorescenza di fondo.
A causa dei bassi livelli di perossido di idrogeno, roGFP2 rimane nella sua conformazione ridotta.
Eccitare il biosensore in sequenza a lunghezze d'onda di 405 e 480 nm.
La riduzione di roGFP2 mostra un picco di eccitazione a 480 nm.
Passare a un mezzo contenente perossido di idrogeno.
Il perossido di idrogeno entra nelle cellule e reagisce con Orp1, ossidando roGFP2.
Eccitare nuovamente il biosensore.
La roGFP2 ossidata mostra un aumento della fluorescenza a 405 nm e una diminuzione a 480 nm.
Calcola il rapporto di intensità della fluorescenza.
Un aumento del rapporto indica un aumento dei livelli di perossido di idrogeno cellulare.
Il giorno dell'imaging, controllare le cellule al microscopio per convalidare la crescita degli assoni RGC. Per l'imaging di cellule vive, trasferire i vetrini coprioggetti dalla piastra di coltura a una camera di imaging di cellule vive. Utilizzare un microscopio invertito dotato di un obiettivo DIC, filtro rosso passa-lungo OG590 e una telecamera EM-CCD.
Prima dell'imaging, sostituire il mezzo ZFCM+ con ZFCM-. Dopo aver posizionato le celle con l'obiettivo 10x, acquisire immagini con ingrandimento 60x utilizzando un obiettivo a immersione in olio. Utilizzare un ingrandimento aggiuntivo di 1,5x.
Innanzitutto, acquisire le immagini DIC, quindi l'immagine roGFP2-Orp1 utilizzando un set di filtri appropriato. Dopo aver scattato la prima serie di immagini, scambiare i terreni con i supporti contenenti diverse soluzioni di trattamento. I terreni devono essere cambiati ogni 30 minuti di imaging per evitare variazioni di pH e osmolarità.