JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:57 min. • July 8th, 2025
Prendiamo le cellule gangliari retiniche del pesce zebra coltivate su vetrini protettivi rivestiti.
Queste cellule esprimono un biosensore geneticamente codificato che produce la proteina fluorescente verde roGFP2 sensibile alla redox fusa con un enzima sensibile al perossido di idrogeno, Orp1.
Trasferire il vetrino coprioggetti con il terreno in una camera di imaging di cellule vive e posizionare la camera su un microscopio invertito.
Sostituire il terreno con un terreno privo di siero per ridurre la fluorescenza di fondo.
A causa dei bassi livelli di perossido di idrogeno, roGFP2 rimane nella sua conformazione ridotta.
Eccitare il biosensore in sequenza a lunghezze d'onda di 405 e 480 nm.
La riduzione di roGFP2 mostra un picco di eccitazione a 480 nm.
Passare a un mezzo contenente perossido di idrogeno.
Il perossido di idrogeno entra nelle cellule e reagisce con Orp1, ossidando roGFP2.
Eccitare nuovamente il biosensore.
La roGFP2 ossidata mostra un aumento della fluorescenza a 405 nm e una diminuzione a 480 nm.
Calcola il rapporto di intensità della fluorescenza.
Un aumento del rapporto indica un aumento dei livelli di perossido di idrogeno cellulare.
Il giorno dell'imaging, cont
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici