Stabilire una configurazione a cellula intera per l'imaging del calcio a due fotoni di fette di cervello

Prendi una pipetta di stimolazione contenente fluorofori rossi insensibili al calcio nel liquido cerebrospinale artificiale, o ACSF.

Posizionare la pipetta vicino al neurone bersaglio in una fetta di ippocampo.

Posizionare una pipetta patch con un elettrodo di registrazione immerso in un elettrolita contenente fluorofori rossi insensibili al calcio e indicatori di calcio verdi vicino al bersaglio.

Applicare una pressione positiva costante per disturbare brevemente la superficie del tessuto, indicando la vicinanza al bersaglio.

Quando la fossetta si forma sulla membrana neuronale, rilasciare la pressione per formare un sigillo.

Applicare una pressione negativa per serrare la guarnizione.

Stabilizzare il potenziale di membrana a una tensione negativa costante.

Continuare con una pressione negativa per rompere la membrana, consentendo agli elettroliti contenenti fluorofori di diffondersi all'interno del neurone.

Visualizzare la fluorescenza rossa della spina dendritica target e allineare la pipetta di stimolazione vicino ad essa.

Applicare impulsi elettrici per aprire i canali del calcio.

Utilizzare la microscopia a due fotoni per visualizzare le variazioni transitorie dei livelli di