JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:29 min. • July 8th, 2025
Prendi un vetrino coprioggetti contenente una coltura neuronale modellata in 1D.
I neuroni sono caricati con un colorante indicatore di calcio, che diventa fluorescente al legame con il calcio.
Trasferire il vetrino coprioggetti in una camera di imaging per microscopio a fluorescenza contenente una soluzione di registrazione extracellulare.
Assemblare un supporto con due elettrodi a filo parallelo separati da una distanza.
Capovolgere il supporto e posizionarlo sopra la coltura neuronale con gli elettrodi immersi nella soluzione di registrazione.
Collegare gli elettrodi a un amplificatore. Applicare un'onda quadra bipolare pulsata non CC per generare un campo elettrico unidirezionale uniforme attraverso i neuroni senza causare lesioni.
Il campo elettrico generato eccita i neuroni, innescando un potenziale d'azione.
Il potenziale d'azione viaggia lungo l'assone, attivando i canali del calcio voltaggio-dipendenti e causando l'afflusso di calcio nel terminale del neurone. Inoltre, i neurotrasmettitori vengono rilasciati nella sinapsi, facilitando la trasmissione sinaptica.
In seguito all'afflusso di ioni calcio, questi ioni si legano al colorante intracellulare e diventano fluorescenti, indicando l'attività neuronale in risposta alla stimolazione elettrica.
Prima di una stimolazione elettrica, posizionare il vetrino coprioggetti posizionato in una camera di imaging. Per stimolare le cellule con un campo elettrico di direzione costante, utilizzare due elettrodi paralleli separati da 11 millimetri e situati ai lati opposti della coltura placcata sui vetrini coprioggetti da 13 millimetri. Quindi, assemblare la camera di imaging della coltura e il supporto dell'elettrodo corrispondente in modo che gli elettrodi a filo siano immersi nel terreno extracellulare e posizionati un millimetro sopra la coltura.
Quindi, collegare la singola coppia di elettrodi all'amplificatore operazionale che amplifica il segnale proveniente dal generatore. Applicare un singolo impulso di onda quadra bipolare con un ciclo di lavoro del 50% e un'ampiezza di 22 volt. Utilizzare un'onda bipolare senza componenti CC per evitare l'elettrolisi che può verificarsi sugli elettrodi. Applicare l'impulso della durata da 10 microsecondi a quattro millisecondi per garantire una stimolazione efficace, ma prevenire lesioni cellulari.