JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:10 min. • July 8th, 2025
Inizia con una camera di registrazione del comportamento contenente una larva di pesce zebra anestetizzata e transgenica immobilizzata in un agarosio a basso punto di fusione.
La regione pretectum del mesencefalo della larva e il lobo inferiore dell'ipotalamo contengono neuroni modificati che esprimono indicatori fluorescenti di calcio.
Rimuovere l'agarosio intorno alla testa della larva e lavare con acqua per rimuovere eventuali residui di agarosio.
Posiziona un paramecio come preda vicino alla larva.
Trasferire la camera di registrazione al microscopio a fluorescenza.
Mentre la preda nuota, l'occhio della larva la rileva e invia un segnale alle regioni del pretectum e dell'ipotalamo coinvolte nel rilevamento della preda.
Questo apre i canali del calcio in questi neuroni, consentendo agli ioni calcio di entrare e legarsi agli indicatori del calcio, portando all'emissione di fluorescenza.
Registra l'imaging time-lapse per rilevare l'intensità della fluorescenza dai neuroni lungo il percorso di nuoto della preda e generare una mappa a colori.
In questa mappa, le punte delle frecce rappresentano le traiettorie delle prede: le frecce nere non mostrano alcuna eccitazione neuronale, mentre le frecce colorate indicano un aumento dell'eccitazione neuronale innescata dal movimento della preda.
Dopo aver coltivato i paramecia e anestetizzato una larva di pesce zebra secondo il protocollo di testo, posizionare la larva in agarosio al 2% a basso punto di fusione e rimuovere immediatamente l'agarosio in eccesso in modo che la superficie dell'agarosio appaia leggermente convessa. Usando un ago da dissezione, orientare rapidamente la larva in posizione verticale.
Quindi, usando un bisturi chirurgico, fai alcuni piccoli tagli nell'agarosio per rimuovere l'agarosio attorno alla testa del pesce zebra, che fa spazio al paramecio per nuotare. Rimuovere con cautela l'agarosio residuo versando delicatamente l'acqua del sistema sulla camera. Quindi, metti un paramecio nella camera di registrazione per fungere da stimolo visivo.
Quindi, posizionare la camera di registrazione sotto un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera CMOS scientifica e selezionare un obiettivo 2,5x. Avviare l'applicazione di acquisizione delle immagini per la fotocamera in dotazione. Fare clic su Riquadro sequenza e selezionare Record disco rigido nel riquadro. Nella sezione Impostazioni di scansione, impostare il numero di fotogrammi su 900 o qualsiasi altro numero di fotogramma totale desiderato.
Nel riquadro Acquisizione, impostare il tempo di esposizione su 30 millisecondi e il binning su 2 per 2. Fare clic su Live nel riquadro di acquisizione per individuare la larva nella vista della fotocamera e mettere a fuoco, quindi fare clic su Interrompi Live e fare clic sul pulsante Start. Salva il filmato in formato .cxd e analizza i dati secondo il protocollo di testo.