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Prelevare una fetta coronale di topo trasfettata immobilizzata in una camera di registrazione perfusa con aCSF.
La fetta contiene una popolazione di neuroni piramidali sparsi che esprimono un enzima bersaglio e una proteina fluorescente.
Assemblare una pipetta di registrazione comprendente una soluzione intracellulare e un elettrodo collegato a un amplificatore per misurare i segnali neuronali.
Identificare al microscopio l'area del tessuto bersaglio e localizzare un neurone fluorescente.
Applicare una pressione positiva sulla pipetta per evitare l'intasamento e farla avanzare verso il neurone bersaglio.
La pressione positiva provoca una leggera rientranza sulla membrana neuronale al contatto.
Rilasciare la pressione, formando una tenuta ermetica tra la membrana e la punta.
Impostare il potenziale di tenuta su un valore negativo costante per stabilizzare il neurone.
Applicare una breve pressione negativa per rompere la membrana, collegando il citoplasma all'interno della pipetta e stabilendo una configurazione dell'intera cellula.
Passa alla modalità di pinza di corrente e applica impulsi di corrente positiva, generando potenziali d'azione indicativi di eccitabilità neuronale.
Trasferisci una fetta nella camera di registrazione usando una pipetta Pasteur o un pennellino. Tenere premuta la fetta con un'arpa e perfonderla con ACSF a una velocità di 2 millilitri al minuto. Per applicare il patch a un neurone GFP-positivo, individuare l'area di interesse attraverso il microscopio a 10x. Quindi, trova una cella GFP-positiva utilizzando l'obiettivo 60x.
Quindi, riempire l'elettrodo di registrazione con una soluzione intracellulare. Successivamente, inserire una pipetta di vetro nel portapipetta. Successivamente, posizionare la punta della pipetta nella vasca da bagno e concentrarsi sulla punta. Una volta che la pipetta è nel bagno, applicare una pressione positiva attraverso il sistema di controllo della contropressione.
Avvicinarsi alla cellula di interesse sotto guida visiva mantenendo la contropressione nella pipetta. Alla comparsa di una piccola fossetta sulla superficie cellulare, rilasciare la pressione. A questo punto si può formare una tenuta ermetica con una resistenza superiore a 1 gigaohm. In caso contrario, applicare una leggera pressione negativa per facilitarlo.
Durante la formazione della guarnizione, portare la tensione di mantenimento clamp a 60 millivolt negativi. Una volta formata la guarnizione gigaohm, applicare un impulso di aspirazione per rompere la membrana cellulare e passare alla modalità a cella intera. Una volta che è in modalità cella intera, passa dalla modalità voltage-clamp alla modalità current-clamp e avvia la registrazione.