Induzione di varici assonali con uno stimolo micromeccanico sui neuroni

Iniziare fissando una micropipetta con tubo collegato a un micromanipolatore.

Collegare l'altra estremità del tubo a una siringa riempita con un tampone salino tramite un connettore con una valvola girevole.

Posizionare la siringa a un'altezza che fornisca una pressione sufficiente per indurre varici negli assoni.

Le varicosità assonali sono gonfiori simili a perline che si verificano lungo la lunghezza di un assone.

Posizionare la micropipetta all'angolazione desiderata rispetto al piatto di coltura.

Utilizzare la luce fluorescente del microscopio per allineare la punta della micropipetta e abbassarla vicino alla superficie della piastra per colture cellulari contenente tampone salino.

Ora accendi la luce trasmessa e spegni il filtro fluorescente.

Posiziona un vetrino coprioggetti con i neuroni sul piatto.

Innanzitutto, concentrati sulla micropipetta e regolane la posizione.

Quindi, concentrati sulla regione contenente i neuroni bersaglio.

Aprire la valvola per applicare la pressione del fluido. Questo stimolo micromeccanico induce varicosità in questi neuroni.

In questa procedura, inserire la pipetta nella parte superiore della vite del micromanipolatore per tenerla in posizione. Inclinare la pipetta di 45 gradi rispetto alla superficie della piastra di coltura cellulare. Attiva il filtro a fluorescenza. Apri l'apertura e assicurati che un punto fluorescente possa essere visto attraverso l'obiettivo.

Utilizzando il micromanipolatore, spostare la pipetta in una posizione che allinei la punta con il punto fluorescente e abbassare la pipetta in una posizione appena sopra l'altezza della capsula di coltura cellulare. Una volta in posizione, accendere la luce trasmessa e spegnere la fluorescenza. Usando una pinzetta, trasferire un vetrino coprioggetti con le cellule rivolte verso la pipetta dalla piastra di coltura cellulare alla piastra di coltura cellulare contenente 2 millilitri di tampone di Hank a temperatura ambiente.

Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine e l'obiettivo 20x, mettere a fuoco su un piano di circa quattro giri completi sopra le celle. Successivamente, utilizzare il micromanipolatore per posizionare la punta della pipetta in modo che sia focalizzata e al centro sul lato sinistro del piano, come visto attraverso gli oculari. Una volta che la pipetta è in posizione, mettere a fuoco il microscopio su un piano che contenga la regione di interesse.

Nell'imaging di 7DIV, i neuroni dell'ippocampo di topo trasfettati con GFP hanno mostrato un assone pre e post-sbuffo.