JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 5:10 min. • July 8th, 2025
Metti embrioni di pesce zebra geneticamente modificati sotto uno stereomicroscopio e osserva l'avvolgimento spontaneo della coda innescato dai motoneuroni del midollo spinale.
Le proprietà intrinseche di questi neuroni causano l'afflusso di ioni attraverso i canali del sodio, portando alla depolarizzazione spontanea della membrana e alla generazione di potenziali d'azione che si propagano ai muscoli, innescando l'avvolgimento della coda. Misurare la frequenza di avvolgimento.
Trasferire alcuni embrioni in un bloccante dei canali del sodio per inibire l'afflusso di sodio e valutare la ridotta frequenza di avvolgimento.
Monta gli embrioni non trattati in agarosio fuso; lascia solidificare l'agarosio per limitare il movimento e osserva al microscopio a fluorescenza.
I motoneuroni esprimono un biosensore con un dominio di rilevamento della tensione legato alla membrana, o VSD, fuso con fluorofori donatori e accettori.
La depolarizzazione modifica la conformazione del VSD, avvicinando i fluorofori.
Dopo l'eccitazione, il donatore trasferisce energia all'accettore, provocando l'emissione di fluorescenza dell'accettore.
Aggiungere il bloccante per inibire la depolarizzazione, che riduce l'emissione dell'accettore, confermando l'inibizione mediata dal bloccante della depolarizzazione spontanea nei neuroni.
Per l'analisi spontanea dell'avvolgimento della coda, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri rotonda da 90 millimetri riempita con acqua di pesce contenente lo 0,2% di DMSO e deteroionarli manualmente utilizzando due pinze da gioielliere con punte o aghi affilati. Successivamente, incubare gli embrioni per 5 minuti a 28 gradi Celsius. Utilizzando una fotocamera digitale montata su uno stereomicroscopio, rilevare l'avvolgimento della coda a temperatura ambiente durante una registrazione video di un minuto.
Successivamente, acquisire la serie temporale con una risoluzione temporale di 30 fotogrammi al secondo. Quindi, calcola la frequenza dell'avvolgimento spontaneo della coda contando il numero di curve per unità di tempo. Per valutare l'effetto del farmaco riluzolo, trasferire gli embrioni in una nuova capsula di Petri da 90 millimetri riempita con acqua di pesce contenente 5 micromolari di riluzolo. Quindi, incubare gli embrioni per 5 minuti a 28 gradi Celsius prima di registrare un video di un minuto ed eseguire l'analisi comportamentale.
Ora, monta gli embrioni da 20 a 24 hpf in agarosio a basso punto di fusione all'1% in acqua di pesce all'interno di una capsula di imaging con fondo di vetro da 35 millimetri a 37 gradi Celsius. Orientare gli embrioni su un lato e attendere che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.
Quindi, trasferire la piastra di imaging sul tavolino di un microscopio confocale. Identificare i motoneuroni che esprimono il biosensore eccitando il monomero Umikinoko-Green con laser ad argon a 488 nanometri. Quindi, imposta la sua emissione tra 495 e 525 nanometri e premi Registra.
Per una misurazione FRET, eccita mUKG, il donatore della coppia FRET con un laser a 488 nanometri. Contemporaneamente, utilizzando due fotomoltiplicatori, rileva la fluorescenza emessa dal donatore e la fluorescenza emessa dall'accettore monomerico Kusabira-Orange. All'inizio dell'esperimento, ottimizzare il guadagno e l'offset del fotomoltiplicatore 1, dove viene registrata la fluorescenza mUKG, e mantenerli costanti per tutta la sessione.
Per impostare l'offset, modificare il colore dell'immagine in base ai valori di intensità utilizzando la tabella Q-lookup. Durante la scansione con un laser spento, utilizzare il cursore di offset in modo che i pixel di sfondo abbiano un'intensità leggermente superiore a zero. Utilizzando la stessa tabella di ricerca, accendere il laser. Durante la scansione, utilizzare il cursore del guadagno per massimizzare il rapporto segnale/rumore, facendo attenzione a evitare pixel saturi.
Nella finestra di acquisizione del software, selezionare la modalità di acquisizione xyt e una dimensione del campo immagine di 512 x 64 pixel dal menu a discesa. Quindi, impostare la registrazione dei cambiamenti nella tensione del neurone spinale dell'embrione per acquisire un singolo piano xy ogni 30 millisecondi per un minuto. Valutare l'effetto della somministrazione di riluzolo sulla depolarizzazione della membrana nello stesso neurone, acquisire un nuovo set di dati cinque minuti dopo l'aggiunta di acqua di pesce contenente 5 riluzolo micromolare.