Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

Monta una mosca Drosophila su un supporto con la testa esposta.

Crea un'apertura in un occhio e rimuovi la cornea per esporre la retina.

Posizionare il supporto sulla piattaforma di registrazione.

Inserire un elettrodo di riferimento smussato contenente una soluzione salina fisiologica nella capsula della testa.

Quindi, inserire un elettrodo di registrazione affilato contenente una soluzione intracellulare che imita l'ambiente attraverso l'apertura nella retina.

Lascia che l'occhio si adatti al buio.

Misurare la resistenza dell'elettrodo di registrazione per garantirne l'idoneità alla registrazione.

Quindi, eliminare la differenza di tensione di base tra gli elettrodi di registrazione e quelli di riferimento.

Durante l'adattamento al buio, specifici canali ionici nelle cellule fotorecettrici retiniche rimangono aperti, consentendo un costante afflusso di ioni positivi.

Stimola l'occhio con lampi di luce.

In risposta, i canali ionici si chiudono, riducendo l'afflusso di ioni positivi e promuovendo l'efflusso.

Di conseguenza, il potenziale di membrana dei fotorecettori diventa più negativo, misurato dall'elettrodo di registrazione come un calo della tensione.

Quando si utilizza l'amplificatore per microelettrodi, essere sempre collegato a terra toccando la superficie metallica della gabbia di Faraday o del tavolo antivibrante per evitare cariche elettrostatiche. Fissare la mosca montata al palo della piattaforma di preparazione delle mosche.

Ruotare il supporto della mosca in modo che l'occhio sinistro della mosca sia rivolto direttamente verso l'investigatore. Quindi, utilizzare un piccolo micromanipolatore grossolano per inserire delicatamente l'elettrodo di riferimento smussato attraverso gli ocelli della mosca nella capsula della testa. Assicurati che la mosca appaia ancora sana e muova le antenne. La preparazione deve essere superba per meritare la registrazione da.

Ora, inserire il microelettrodo di registrazione affilato nell'occhio sinistro attraverso l'apertura rivestita di gelatina. Quando entra nel tessuto, la posizione della punta dell'elettrodo dovrebbe essere evidente dal suo modello di riflettanza. La fragile punta dell'elettrodo deve essere guidata perfettamente, altrimenti si romperà, il che è molto impegnativo.

A seconda del tipo di cellula da cui viene registrata, la testa della mosca dovrebbe essere orientata in modo leggermente diverso. Con gli elettrodi in posizione, accendere l'amplificatore per microelettrodi. Quindi spegnere la fonte di luce fredda, scollegarla dalla rete e collegarla alla messa a terra centrale per ridurre al minimo il rumore elettrico indotto dal loop di terra.

Quindi, regolare le guide luminose a collo d'oca in modo che il sistema del braccio cardanico possa essere spostato liberamente intorno alla mosca. Quindi, spegni le luci della stanza per mettere la preparazione della mosca in relativa oscurità. Ora, misura la resistenza dell'elettrodo di registrazione nell'occhio. Deve essere compreso tra 100 e 250 megaohm.

Quindi, impostare l'amplificatore su una pinza amperometrica o un ponte e azzerare la tensione tra gli elettrodi. Dopo che la mosca è stata adattata al buio per alcuni minuti, guidare la punta dell'elettrodo di registrazione nell'occhio in incrementi da 0,1 a 1 micron utilizzando un piezoelettrico stepper o ruotando delicatamente la manopola a risoluzione fine.

Ad ogni passo, stimola l'occhio con un lampo di luce da 1 a 10 millisecondi. Ogni lampeggio di luce causerà un breve calo della tensione o dell'ERG.