Monitoraggio dei segnali elettrici dai neuroni afferenti in una larva di pesce zebra immobilizzata

Inizia con una larva di pesce zebra immobilizzata e paralizzata in una camera di registrazione riempita con una soluzione extracellulare in una configurazione di elettrofisiologia.

Riempire una micropipetta afferente con la soluzione extracellulare contenente ioni che forniscono la conduttività elettrica per la registrazione dell'attività neuronale.

Assemblarlo in un micromanipolatore contenente un elettrodo di registrazione collegato a un amplificatore per la registrazione del segnale.

Applicare una pressione positiva dell'aria per evitare l'intasamento della pipetta.

Spostare la punta della pipetta lungo il nervo della linea laterale e posizionarla adiacente al ganglio afferente che contiene un gruppo di corpi cellulari neuronali afferenti.

I processi cellulari di questi neuroni sono collegati alle cellule ciliate situate lungo la linea laterale, che percepiscono i movimenti dell'acqua.

Quindi applicare una leggera pressione negativa per formare un sigillo allentato tra la micropipetta e il ganglio afferente.

Registra i segnali elettrici dai neuroni afferenti, che ricevono l'input sensoriale dalle cellule ciliate nella larva immobilizzata.

Immobilizzare le larve di pesce zebra e trasferirle in una capsula di Petri da 35 millimetri utilizzando una pipetta di trasferimento a punta larga. Rimuovere la maggior parte possibile della soluzione circostante. Immergere le larve in 10 microlitri di 0,1% di alfa bungarotossina per circa cinque minuti. Lavare la larva paralizzata con soluzione extracellulare per 10 minuti. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare la larva dal bagno di soluzione extracellulare al piatto di registrazione con fondo in silicone.

Sotto uno stereomicroscopio, posizionare delicatamente le larve con una pinza a punta fine sopra il centro del tappetino in silicone, con il lato laterale rivolto verso l'alto con le estremità anteriore e posteriore del corpo che corrono da sinistra a destra. Utilizzando una pinza a punta fine, inserire il perno inciso ortogonalmente al silicone attraverso la notocorda dorsale delle larve, direttamente dorsale all'ano. Inserire il secondo perno attraverso la notocorda vicino all'estremità della coda e inserire il terzo perno attraverso la dorsale della notocorda della camera d'aria del gas. Inserire il quarto perno attraverso la vescicola otica fornendo una leggera rotazione mentre il perno si inserisce nell'incapsulante.

Quando viene applicata una leggera rotazione, osservare il tessuto tra il cleitro e la vescicola otica per rivelare il grappolo di somata afferente. Posizionare la lava appuntata sotto l'obiettivo 10 volte su un tavolino fisso del microscopio DIC e orientare le fessure miosettali dei blocchi muscolari parallelamente al vettore sinistro dello stadio della testa.

Posizionare il filo di terra nella soluzione del bagno e assicurarsi che sia collegato allo stadio di testa sinistro. Riempire l'elettrodo di registrazione afferente con 30 microlitri di soluzione extracellulare e inserirlo nel portapipetta dello stadio destro della testa. Quindi, abbassarlo nella soluzione del piatto applicando la pressione positiva prodotta da un trasduttore pneumatico.

Individuare l'elettrodo e portare la punta dell'elettrodo sopra il campione. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo afferente fino a quando non si mantiene in posizione sopra il cleitro. Aumentare l'ingrandimento a 40 volte l'immersione e individuare l'intersezione del nervo della linea laterale posteriore e del cleitro. Portare la punta dell'elettrodo sopra il ganglio afferente e abbassare la pipetta fino a quando la punta non tocca l'epitelio. Manovrare delicatamente l'elettrodo in modo che l'intera circonferenza della punta entri in contatto con il ganglio afferente.