JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:10 min. • July 8th, 2025
Prendi una fetta di cervello di topo immobilizzato colorato con un colorante sensibile alla tensione o VSD, molecole fluorescenti che si integrano nella membrana neuronale e rispondono ai cambiamenti del potenziale di membrana.
Posizionare la fetta in una camera di registrazione.
Installare l'elettrodo di terra per un riferimento di tensione di base.
Successivamente, posizionare gli elettrodi di stimolazione e registrazione sulla fetta.
Applicare un impulso elettrico.
L'impulso stimola i neuroni, innescando l'apertura del canale del sodio voltaggio-dipendente e l'afflusso di ioni sodio, portando a un cambiamento del potenziale di membrana.
Ciò induce un potenziale d'azione, misurato dall'elettrodo di registrazione, e altera le proprietà fluorescenti del VSD.
Esporre la fetta di cervello a una lunghezza d'onda specifica per eccitare il VSD e innescare l'emissione di fluorescenza.
Dopo la stimolazione, i canali del sodio si chiudono mentre i canali del potassio voltaggio-dipendenti si aprono, favorendo l'efflusso di ioni potassio.
Questo cambia nuovamente il potenziale di membrana e di conseguenza altera la fluorescenza del VSD.
Registra la fluorescenza in tempo reale per rappresentare visivamente l'attività neuronale.
Per iniziare questa procedura, accendere l'amplificatore, il computer e il sistema della fotocamera e aprire il software. Versare l'aCSF in un tubo da 50 millilitri e bollirlo con il carbogeno. Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare l'aCSF e regolare la portata a circa un millilitro al minuto.
Quindi, regolare l'altezza della pipetta di aspirazione in modo che il livello del liquido all'interno della camera sperimentale sia sempre costante. Posizionare l'elettrodo di terra nella camera. Successivamente, riempire l'elettrodo di vetro con una piccola quantità di aCSF e posizionarlo nel portaelettrodo. Fissare il supporto all'asta del manipolatore.
Utilizzando un amplificatore, assicurarsi che la resistenza dell'elettrodo sia di circa 1 megaohm. Nella sessione di registrazione, trasferire una fetta dalla camera umida a una camera sperimentale. Premere saldamente il bordo dell'anello nell'O-ring in silicone. Fare attenzione a non rompere la membrana o il fondo della camera sperimentale.
Al microscopio, posizionare la punta dell'elettrodo stimolante e l'elettrodo di registrazione del potenziale di campo sulla fetta. Controlla la risposta evocata erogando uno stimolo. Verificare che il campo visivo copra il circuito neurale destro nel sistema di registrazione ottica.
Quindi, regolare l'intensità della luce di eccitazione a circa il 70-80% della capacità massima della fotocamera. Utilizzando la sorgente luminosa fluorescente, regolare la messa a fuoco con il sistema di acquisizione. Quindi, avviare la registrazione e analizzare i dati in un software di acquisizione immagini dopo l'acquisizione.