JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
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Inizia con un topo che si muove liberamente con una cannula in fibra ottica impiantata.
Collegare un'estremità di un cavo patch in fibra ottica alla cannula e l'altra estremità a una sorgente luminosa di eccitazione.
Il topo esprime un indicatore di calcio geneticamente codificato con fluoroforo verde, o GECI, nell'area ipotalamica laterale, o neuroni LHA.
La fibra ottica impiantata entra in contatto con la regione laterale dell'habenula, o LHb, dove terminano gli assoni LHA.
Eccitare il GECI alla sua lunghezza d'onda di eccitazione ottimale e registrare il segnale di base.
Ora, applica sbuffi d'aria ripetuti al mouse per evocare una risposta avversiva allo stress.
Questo stimolo innesca potenziali d'azione nei terminali degli assoni LHA, aprendo i canali del calcio voltaggio-dipendenti e consentendo l'afflusso di calcio.
Gli ioni calcio intracellulari si legano al GECI, inducendo un cambiamento conformazionale che aumenta l'emissione di fluorescenza verde.
Visualizzare il segnale ottico.
L'aumento della fluorescenza in risposta agli sbuffi d'aria nel topo conferma il ruolo della via LHA-LHb nella trasmissione di segnali avversivi.
Inizia ispezionando l'estremità distale delle fibre del cavo patch a occhio e con un mini microscopio a fibra. Se la superficie delle fibre è graffiata, rilucidare le fibre utilizzando un film lucidante per fibre a grana fine. Quindi, pulire le estremità distali del cavo patch con etanolo al 70% e un applicatore con punta di cotone. Pulire le cannule in fibra ottica utilizzando etanolo al 70% e un applicatore con punta di cotone.
Collegare l'estremità della ghiera del cavo patch alla fibra impiantata utilizzando un manicotto diviso in ceramica coperto da un tubo termoretraibile nero. Durante il collegamento, assicurarsi che il manicotto sia ben saldo. Lascia che l'animale si riprenda per qualche minuto, quindi inizia a registrare il segnale ottico ed esegui l'esperimento. Durante la registrazione, tenere d'occhio la traccia in tempo reale per garantire registrazioni di qualità e prestare attenzione a eventuali salti nel segnale che indicano che il manicotto non è abbastanza stretto.