JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:05 min. • July 8th, 2025
Prendete una fetta di cervello di topo immobilizzato e trasfettato in una camera di registrazione elettrofisiologica perfusa con aCSF ossigenato.
Questa fetta contiene i terminali degli assoni dei neuroni talamici che esprimono canali ionici sensibili alla luce fusi a una proteina fluorescente.
Visualizza gli assoni fluorescenti dei neuroni talamici e seleziona un neurone piramidale.
Far avanzare una pipetta di registrazione contenente un elettrodo in una soluzione intracellulare verso il neurone selezionato con una leggera pressione positiva.
La pressione positiva crea una fossetta sulla membrana neuronale al contatto.
Rilasciare la pressione per formare una tenuta ad alta resistenza.
Impostare il potenziale di membrana su un valore negativo costante.
Applicare un impulso di pressione negativa per rompere la membrana, ottenendo una configurazione a cellula intera.
Illumina i terminali degli assoni, attivando i canali sensibili alla luce e depolarizzando le membrane neuronali, innescando potenziali d'azione.
I neurotrasmettitori eccitatori vengono rilasciati, legandosi ai recettori sul neurone registrato, causando l'afflusso di cationi.
Registrare le correnti post-sinaptiche eccitatorie risultanti, indicando una connessione sinaptica diretta tra i neuroni.
Per eseguire la registrazione con patch clamp a cellula intera, trasferire delicatamente una fetta di cervello contenente il complesso ippocampale nella camera di registrazione. Perfondere continuamente la camera di registrazione con 34 gradi Celsius ACSF gorgogliata con carbogeno a 2-3 millilitri al minuto. Esaminare brevemente l'espressione della GFP del crono nei terminali degli assoni nella regione di interesse con illuminazione a LED blu con ingrandimento 4x.
Passa a un obiettivo a immersione 63x e regola la messa a fuoco. Verificare la presenza di assoni che esprimono Chronos GFP e scegliere un neurone piramidale per la registrazione delle patch. Quindi, riempire una pipetta con una soluzione interna a base di gluconato di potassio. Montarlo nel portapipette sullo stadio della testa. Applicare un patch alla cella in configurazione voltage clamp.
Avvicinarsi al neurone identificato e premere delicatamente la punta della pipetta sul soma. La pressione positiva dovrebbe produrre una fossetta sulla superficie della membrana. Quindi, rilasciare la pressione per creare una tenuta giga ohm. Una volta sigillato, impostare la tensione di mantenimento a meno 65 millivolt.
Rompere la membrana con un forte impulso di pressione negativa. Registrare in corrente o in morsetto di tensione le risposte postsinaptiche alla stimolazione a campo intero LED a 475 nanometri di fibre afferenti che esprimono chronos. Stimola con treni di 10 stimolazioni della durata di 2 millisecondi a 20 hertz.