JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:08 min. • July 8th, 2025
Inizia perfondendo un liquido cerebrospinale artificiale aerato o aCSF su una griglia a maglie in una camera di perfusione.
Trasferisci una fetta di cervello contenente neuroni fluorescenti che esprimono proteine e ancorala con un dispositivo cablato al platino.
Ruotare la griglia mesh per l'allineamento.
Abbassare la sonda multicanale verso la fetta.
Regolare il cubo del filtro per la visualizzazione delle proteine fluorescenti.
Ruotare la fetta per allineare la sonda.
Regolare l'altezza della sonda sotto la superficie del tessuto.
Ora, perfondi l'aCSF e concentrati sui neuroni marcati in fluorescenza.
Utilizzando un obiettivo ad alta potenza, mettere a fuoco il tessuto e regolare la luce di eccitazione.
Utilizzare un filtro di luce appropriato per osservare la fluorescenza nei neuroni.
Regolare la lente dell'obiettivo per creare spazio per la pipetta per cerotti e applicare una pressione positiva.
Quindi, posizionare la pipetta vicino al neurone per formare una fossetta di membrana.
Infine, applicare un'aspirazione debole per creare una tenuta della membrana, seguita da una forte aspirazione per rompere la membrana e ottenere registrazioni elettriche dal neurone mirato.
Per posizionare la sonda multicanale nel vetrino di tessuto cerebrale ex vivo, perfuse ha fatto gorgogliare ACSF sperimentale a una velocità compresa tra tre e sei millilitri al minuto e trasferire la fetta di cervello contenente l'area di interesse sulla griglia a maglie nella camera di perfusione del microscopio. Ancorare la fetta di cervello con un'arpa di platino. Ruotare la griglia a maglie in modo che la linea dei contatti degli elettrodi sull'estremità distale della sonda multicanale sia approssimativamente perpendicolare alla superficie PL.
In condizioni di illuminazione ad ampio campo e controllo preciso del micromanipolatore, abbassare la sonda multicanale verso la superficie della fetta. Attivare il cubo filtrante appropriato per la visualizzazione della proteina reporter fluorescente espressa nei terminali assonici delle afferenze corticali.
Se necessario, ruotare la fetta per allineare in modo più preciso la sonda con la superficie PL. Posizionare la sonda appena sopra il piano della fetta, a 200 micrometri dalla posizione finale del bersaglio lungo l'asse x, lasciando almeno un canale al di fuori dell'area di tessuto da registrare. Lentamente, inserire la sonda nella fetta lungo il suo asse longitudinale.
Per ridurre al minimo i danni al tessuto, far avanzare la sonda solo nella misura in cui le punte affilate sono appena visibili sotto la superficie del tessuto. Passare dalla sorgente ACSF sperimentale alla soluzione di controllo in busta e identificare la cella marcata in fluorescenza per la registrazione mirata del patch-clamp. Limitare l'apertura al diametro più piccolo e innestare l'obiettivo a immersione in acqua ad alta potenza, facendo attenzione a evitare il contatto tra la sonda multicanale e la lente dell'obiettivo. Metti a fuoco il tessuto.
Centrare la luce su un'area di tessuto adiacente, ma non sovrapposta alla sonda multicanale. Attivare il set di filtri appropriato per consentire l'imaging delle cellule che esprimono il marcatore fluorescente Cre-dipendente. Sollevare la lente dell'obiettivo per creare ampio spazio per l'abbassamento di una pipetta per cerotto.
Caricare una pipetta patch con soluzione interna e montata sul portaelettrodo. Utilizzare una siringa da un millilitro per applicare una pressione positiva corrispondente a circa 0,1 millilitri d'aria. Abbassare la pipetta per cerotti nella soluzione, mettendo a fuoco la punta sotto guida visiva, e ottenere la registrazione dell'intera cellula dalla cellula bersaglio.