JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:14 min. • July 8th, 2025
Prendete una fetta coronale di topo immobilizzata geneticamente modificata in una camera di registrazione perfusa con tampone ossigenato.
La fetta contiene la regione striatale, che ha interneuroni riprogrammati da cellule precursori di oligodendrociti marcate da un marcatore interneuronale e dall'espressione di proteine fluorescenti.
Assemblare una pipetta di registrazione costituita da un elettrodo immerso in una soluzione intracellulare.
Identificare microscopicamente un interneurone fluorescente.
Mantenere una pressione positiva nella pipetta e farla avanzare verso l'interneurone bersaglio, a contatto con la membrana.
Applicare una pressione negativa per formare una tenuta ad alta resistenza.
Applicare impulsi di pressione negativa per rompere la membrana, stabilendo una configurazione dell'intera cellula.
Mantenere il potenziale di membrana dell'interneurone a un valore negativo costante.
Applicare brevi correnti incrementali, aprendo i canali ionici e modificando il potenziale di membrana, innescando un potenziale d'azione.
Alla fine, la membrana ritorna al potenziale di riposo.
Osservare questi cambiamenti nel potenziale di membrana in risposta all'iniezione di corrente, indicando la maturazione neuronale e la riprogrammazione di successo.
Dopo aver trasferito una sezione di tessuto in una camera di registrazione per l'elettrofisiologia, montare la pipetta di vetro sull'elettrodo di registrazione e immergerla nella soluzione. Ricontrollare la resistenza dell'elettrodo. Quindi, avvicinarsi lentamente alla cella riprogrammata con la pipetta, mantenendo una leggera pressione positiva nell'elettrodo per evitare di ostruire il puntale, e verificare che la cella sia GFP-positiva prima di applicare il patch.
Quando la cella è patchata, mantenere la cella in pinza di corrente da meno 60 a meno 70 millivolt e iniettare correnti di 500 millisecondi da meno 20 a più 90 picoampere con incrementi di 10 picoampere per indurre potenziali d'azione. Questo è indicativo di una maturazione neuronale e di una riprogrammazione di successo.