JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:18 min • July 8th, 2025
Inizia con un padiglione auricolare di topo sezionato, o orecchio esterno, con i nervi collegati esposti.
Inserire il nervo destinato alla registrazione nell'elettrodo di registrazione.
Rimuovere lo strato di grasso vicino al margine del padiglione auricolare per esporre la base del follicolo pilifero, quindi piegare la pelle per esporre i peli per la stimolazione.
Posizionare una sonda di stimolazione meccanica per toccare e deviare i peli.
Questa stimolazione attiva le terminazioni nervose sensoriali, apre i canali ionici meccanicamente dipendenti, consente l'afflusso di ioni positivi e genera potenziali d'azione.
I potenziali d'azione si propagano attraverso queste terminazioni al nervo registrato. Visualizza il segnale.
Quindi, aggiungi una tintura fluorescente e continua la stimolazione dei capelli.
Il colorante si lega alle membrane neuronali stimolate e viene internalizzato tramite endocitosi senza influenzare l'attività neuronale.
Dopo la stimolazione, lavare per rimuovere il colorante non legato.
Aggiungere un agente sequestrante per rimuovere il colorante legato alla membrana non internalizzato.
Utilizzando la microscopia a fluorescenza, visualizzare la colorazione nei follicoli piliferi per identificare le terminazioni nervose stimolate meccanicamente.
Per effettuare registrazioni controllate dei potenziali d'azione evocati dallo stimolo, utilizzare una sonda meccanica di vetro borosilicato da 10 centimetri lucidato a fuoco collegata a un attuatore piezoelettrico ceramico. Posizionare la sonda in modo che si muova parallelamente alla piega della pelle e tocchi i peli, non la pelle. Mettilo a circa mezzo o un millimetro sopra la superficie della pelle. Quindi, verificare manualmente la stimolazione ascoltando l'uscita audio quando la sonda si muove.
Ora, imposta il software per guidare la stimolazione meccanica di una piccola area di peli. Ad esempio, programma stimolazioni di tre secondi a cinque sinusoidi Hertz ogni 10 secondi. Ciò richiede uno spostamento della sonda compreso tra 200 e 2000 micron. Quindi, procedere utilizzando la stimolazione automatica ripetuta per verificare la coerenza delle risposte registrate nei nervi. I risultati ripetibili dovrebbero essere raggiungibili.
Quando i risultati sono coerenti, ridurre la frequenza di ripetizione a ogni 30 secondi. Ulteriori istruzioni sono fornite nel protocollo di testo. Per studiare le proprietà dei canali meccanosensoriali ed etichettare i terminali meccanosensoriali attorno ai follicoli piliferi, aggiungere 10 micromolari FM143 alla soluzione e lasciare agire per 60 minuti, continuando a stimolare i peli con la sonda oscillante.
Questo colorante blocca i canali trasduttori candidati nei neuroni sensoriali in coltura e nelle cellule ciliate della coclea. Tuttavia, non blocca l'attivazione in situ nelle afferenze del follicolo pilifero maturo. L'etichettatura delle estremità mostra che il colorante agisce come i terminali, che continuano a rispondere alla stimolazione meccanica durante l'esposizione al colorante.